[发明专利]粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，属于生物技领域。

背景技术

禾谷镰刀菌广泛分布于世界范围的温暖潮湿地区，它可以引起麦类作物的根腐、苗腐和穗腐，也能引起玉米的穗腐和茎基腐。禾谷镰刀菌侵染小麦，引起小麦的赤霉病，是我国东北麦区和长江流域最主要的病害，近年来还有扩大蔓延的趋势。在粮食储藏过程中，尤其是在夏季高温潮湿的环境中，禾谷镰刀菌生长速度快，毒素会随着菌体的生长不断的累积。毒素累积量超过国家标准后粮食就不能被人畜食用，失去商品价值，需要另作处理。因此会造成巨大的经济损失。种子带菌是合谷镰刀菌侵染禾谷类作物的一种重要方式，播种染菌种子增加了禾谷类作物感染赤霉病的几率，这会对粮食产量产生直接影响。

禾谷镰刀菌不同菌株(不同采集地、寄主、感染部位)产生毒素的种类和能力有很大的差异。但主要有两大类：单端孢霉烯族毒素化合物(Trichothecenes)和玉米赤霉烯酮(ZEN)。

单端孢霉烯族毒素的基本结构为四环的倍半萜，其上的环氧集团是毒性的主要来源。根据特异功能基团的不同有A、B、C、D四种类型。A型和B型为天然污染的单端孢霉烯族毒素化合物。B型化合物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与雪腐镰刀菌烯醇(NIV)为其主要两种毒素。单端孢霉烯族毒素化合物的急性中毒症状表现为呕吐、恶心、眩晕、便血、手足发麻等。慢性中毒有基因毒性、细胞毒性和免疫毒性。

玉米赤霉烯酮(ZEN)又称F-2毒素。是一种表现类雌性激素样作用的真菌毒素毒素，具有强烈的致畸作用，具有生殖发育毒性、免疫毒性和基因毒性，尤其破坏生殖系统及肝脏器官，对肿瘤的发生也有一定促进作用。

目前检测粮食中DON、NIV、ZEN毒素的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法。酶联免疫法特异性强、灵敏度高，但ELISA试剂盒以及检测设备较昂贵。高效液相色谱法灵敏度高、可以定量检测样品中的毒素含量，但操作过程较繁琐需要专业人员操作，另外检测设备价格昂贵无法用于基层粮库中粮食的检测。多重PCR方法检测多种毒素及禾谷镰刀菌目前国内外还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效简便的方法检测粮食中的脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、雪腐镰刀烯醇(NIV)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及禾谷镰刀菌。

一种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，检测步骤包括：将待检测粮食研磨成粉，用CTAB法提取总DNA；以所提DNA作为模板进行多重PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测粮食中是否被禾谷镰刀菌侵染以及是否含有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、雪腐镰刀烯醇(NIV)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。

所述的检测方法，具体步骤如下：

1.粮食样品的前处理：粮食样品20000rpm粉碎1min。

2.总DNA的提取：

a.取样品粉末于1.5mL离心管中，CTAB提取缓冲液，轻轻摇动使粉末均匀分散于缓冲液中，65℃水浴20min；

b.冷却至室温后，加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻轻混匀，10,000rpm离心10min；

c.吸取上层水相。加入1/10体积的10％CTAB-0.7M NaCl，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，10,000rpm离心10min；

d.吸取上层水相，加入等体积的冰冻异丙醇，轻轻摇动，出现白色DNA絮状沉淀，4,000rpm离心10min，倒掉上清，加入70％乙醇浸泡DNA，其间换洗70％乙醇2-3次；

e.倒掉70％乙醇.用滤纸吸干多余的水分，风干；

f.用适量TE缓冲液溶解DNA.加入RNase A至终浓度为20μg/mL后，37℃条件下保温30min，-20℃保存。

3.PCR扩增

a.扩增体系：10×PCR Buffer 2.5μL；Mg²⁺(10μM)1.5μL；dNTPs(2mM)2.0μL；引物1上下游各1.5μL；引物2上下游各1.0μL；引物3上下游各0.8μL；DNA模板1μL；Taq酶(5U/μL)0.25μL；ddH₂O 12.15μL。

b.PCR反应条件：

c.琼脂糖凝胶电泳