[发明专利]粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，检测步骤包括：将待检测粮食研磨成粉，用CTAB法提取总DNA；以所提DNA作为模板进行多重PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带从而确定所检测粮食中是否被禾谷镰刀菌侵染以及是否含有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)、雪腐镰刀烯醇(NIV)、玉米赤霉烯酮(ZEN)。

2.如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述的检测方法具体步骤如下：

1)、粮食样品的前处理：粮食样品20000rpm粉碎1min；

2)、总DNA的提取：

a.取样品粉末于离心管中，CTAB提取缓冲液，轻轻摇动使粉末均匀分散于缓冲液中，65℃水浴20min；

b.冷却至室温后，加入苯酚：氯仿：异戊醇，苯酚：氯仿：异戊醇比例25：24：1，混匀，10,000rpm离心10min；

c.吸取b步骤上层水相，加入1/10体积的10％CTAB-0.7M NaCl，混匀，再加入等体积的氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇比例24:1，混匀，10,000rpm离心10min；

d.吸取c步骤上层水相，加入等体积的冰冻异丙醇，轻轻摇动，出现白色DNA絮状沉淀，4,000rpm离心10min，倒掉上清，加入70％乙醇浸泡DNA，其间换洗70％乙醇2-3次；

e.倒掉70％乙醇.用滤纸吸干多余的水分，风干；

f.用TE缓冲液溶解DNA.加入RNase A至终浓度为20μg/mL后，37℃条件下保温30min，-20℃保存；

3)、PCR扩增

a.扩增体系：10×PCR Buffer 2.5μL；Mg²⁺(10μM)1.5μL；dNTPs(2mM)2.0μL；引物1上下游各1.5μL；引物2上下游各1.0μL；引物3上下游各0.8μL；DNA模板1μL；Taq酶(5U/μL)0.25μL；ddH₂O 12.15μL；

b.PCR反应条件：

c.琼脂糖凝胶电泳：

取PCR产物及核酸分子量参照物(DL 2000)，在1％琼脂糖凝胶上稳压120V，电泳30min；若样品中有禾谷镰刀菌则会有400-500(bp)扩增产物；若样品中有脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)则会有234bp扩增产物；若样品中有雪腐镰刀烯醇(NIV)则会有415bp扩增产物；若样品中有玉米赤霉烯酮(ZEN)则会有1076bp扩增产物；

所述的提取总DNA方法中，第a步CTAB缓冲液的成分为：100mMTris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA-Na，1.4mM NaCl，2％CTAB，2％β-巯基乙醇。

3.如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述的提取总DNA方法中，第c步10％CTAB-0.7M NaCl的成分为：4.1％NaCl，10％CTAB。

4.如权利要求1所述的粮食中三种真菌毒素及禾谷镰刀菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述的提取总DNA方法中，第f步TE缓冲液成分为：10mM Tris-Cl(pH8.0)，l mM EDTA(pH8.0)。