[发明专利]一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

桉树(Eucalyptus spp.)是桃金娘科(Myrtaceae)桉树属植物的总称，是世界著名的速生树种，也是我国重要的三大速生用材树种之一。由于其具有品质优良，生长迅速，适应性强，用途广泛，以及较高的经济回报效率等特点而被在我国广泛引种，并大量栽培于广东、广西、福建、四川、云南、海南等南方地区。目前，由Cylindrocladium scoparium(桉树焦枯病原菌)引起的桉树焦枯病被定义为一种世界性病害，严重威胁着澳大利亚、美国、中国、巴西、日本、印度尼西亚、泰国、越南等几十个桉树种植较为密集的国家。桉树焦枯病主要侵害桉树4龄及其以下的苗木，桉树焦枯病原菌侵染植株林区后，轻者易造成植株萎蔫及落枝、落叶等现象；重者则会出现感病苗木叶片全部脱落、顶枯、植株枝条全部枯死等现象，危害十分严重。由于桉树焦枯病可造成严重的经济损失，严重影响桉树生产林的建设，因此我国在1996年1月5日便将其列入森林植物检疫对象。因此检测桉树是否携带焦枯病原菌对于桉树焦枯病的防治意义重大，同时也是减少桉树经济损失的重要保障。

目前，经报道，在中国广西、福建、海南、四川等多个省市和地区具有桉树焦枯病的发生，其病原菌主要以Cylindrocladium scoparium(桉树焦枯病原菌)为主。桉树焦枯病发生面积甚广，已严重威胁着中国现今桉树的林业生产建设。为此，亟需建立快速灵敏的检测方法，为桉树焦枯病的防治提供依据。

近年来，分子生物学技术发展迅速，已广泛应用于植物病原真菌的分类鉴定中。PCR技术及基于PCR的检测方法快速、准确、灵敏，在植物病害的检测上发挥着不可替代的作用。LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)，又称“环介导等温扩增反应”，是日本学者Notomi等发明的一种新型、快速、简便的核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件(一般在60-65℃之间)反应30-75分钟，即可实现核酸的快速扩增，目前已被广泛的应用于细菌、病毒、寄生虫的快速检测，但在真菌上的应用报道相对较少。与常规的PCR反应相比，LAMP方法操作简单，不需昂贵的PCR反应仪器即可实现病原菌的快速检测，且判断结果更为人性化，仅需加入荧光染色剂用肉眼判断，特异性和灵敏度也相对常规PCR反应高。

迄今为止，国内外对桉树焦枯病原菌在快速检测方面的报道仍处于空白，因此建立高效、快速的桉树焦枯病原菌(Cylindrocladium scoparium)LAMP检测技术势在必行，同时为桉树焦枯病的发生和防治提供重要的技术手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测桉树焦枯病原菌中存在的不足，提供了一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒，其包括：

(1)10×ThermopolⅡ；

(2)100mMMgCl₂；

(3)2.5mMdNTPs；

(4)5M甜菜碱溶液；

(5)ddH₂O；

(6)40μM的内引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的环状引物LooPF和LooPB；其中，前内引物FIP的序列为5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后内引物BIP的序列为5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列为5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列为5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，环状引物LooPF的序列为5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，环状引物LooPB的序列为5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；

(7)8UBstDNA聚合酶大片；

(8)SYBRGreenI荧光染料。

所述的LAMP检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；