[发明专利]一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种桉树焦枯病原菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包括：

(1)10×ThermopolⅡ；

(2)100mMMgCl₂；

(3)2.5mMdNTPs；

(4)5M甜菜碱溶液；

(5)ddH₂O；

(6)40μM的内引物FIP和BIP，10μM的外引物F3和B3；10μM的环状引物LooPF和LooPB；其中，前内引物FIP的序列为5＇－TGCGCGCTCTTTCGCTACATACACAACGGTACCTCCGACC－3＇，后内引物BIP的序列为5＇－CGCTCACCCTGCGAGAAACAGCGCGAGGAACATACTTGTT－3＇，前外引物F3的序列为5＇－CTCGACAGCAATGGTGTCT－3＇，后外引物B3的序列为5＇－GCTCAAGATCGACGAGGAC－3＇，环状引物LooPF的序列为5＇－GTAGACGTTCATGCGCTCC－3＇，环状引物LooPB的序列为5＇－ATTATTTGTGAGTGTGATAG－3＇；

(7)8UBstDNA聚合酶大片；

(8)SYBRGreenI荧光染料。

2.根据权利要求1所述的LAMP检测试剂盒的使用方法，其特征是，其步骤如下：

(1)提取纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA；

(2)所述的反应体系50μL，包含：10×ThermopolⅡ2.5μl；100mMMgCl₂2μl；2.5mMdNTPs3.5μl；5M甜菜碱溶液3.0μl；ddH₂O33.0μl；40μM内引物FIP/BIP各1μl；10μM外引物F3/B3各0.5μl；10μM环状引物LooPF/LooPB各1μl；8UBstDNA聚合酶大片1μl；加纯培养菌株基因组DNA或所取植物组织样总DNA提取液2.0μL，组成反应混合液；

(3)PCR反应条件为：将反应混合液置于65℃的水浴锅中反应65min，随后80℃灭活3min结束反应；

(4)结果判定：①用肉眼观察反应液是否为白色浑浊，白色浑浊即为阳性，否则为阴性；②将反应产物PCR管放在紫外灯下照射，若有白色则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无白色则说明不含桉树焦枯病原菌；③在扩增产物中加入SYBRGreenI荧光染料观察颜色变化，反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，颜色保持不变为阴性；④扩增结束后取5.0μLPCR产物上样于含0.5μg/mLEB的2％琼脂糖凝胶上电泳，电压为9V/cm、时间为30min，在凝胶成像系统上检测并拍照，观察是否产生特征性梯状电泳条带，有条带则说明样品中存在桉树焦枯病原菌，无条带则说明不含桉树焦枯病原菌。