[发明专利]一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法及其药物组合物

说明书

技术领域

本发明为生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇衍生化的重组人粒细胞刺激因子的制备方法及其包含该刺激因子的药物组合物。

背景技术

粒细胞刺激因子(G-CSF)与造血细胞的表面受体结合从而刺激增生和阻止功能活化细胞增生。美国FDA于1991年批准重组人粒细胞刺激因子上市，商品名通用名非格司亭(Filgrastim)。Filgrastim是一种水溶性的蛋白，含有175个氨基酸，分子量约19千道尔顿，由E.coli发酵获得。Filgrastim的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

G-CSF的聚乙二醇衍生化可以降低血浆清除率，延长半衰期。美国FDA于2002年批准了聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)上市，商品名用于非髓性恶性肿瘤患者在接受会发生有临床意义发热性中性粒细胞减少的抑制骨髓的抗肿瘤药治疗时，降低因发热性中性粒细胞减少而引起的感染发生率。是Filgrastim与单甲氧基聚乙二醇的共价缀合物，由FilgrastimN端甲硫氨酸的氨基与单甲氧基聚乙二醇共价结合。单甲氧基聚乙二醇的分子量约为20千道尔顿，的平均分子量约为39千道尔顿。

现有技术中已知的制备PEG-rhG-CSF的方法操作步骤复杂，成本高，不利于工业化生产，例如，CN1824324A中公开的制备PEG-rhG-CSF的方法，在制备开始时需要更换缓冲液，在制备过程中需要加入额外的试剂DMMAn(二甲基马来酸酸酐)，并且反应温度达到了37℃；CN101711876A中公开的制备PEG-rhG-CSF的方法，需要在反应结束时加入大量的甘氨酸终止反应，并且在纯化过程中需要使用S-200、DEAE和CM柱等三种层析柱，增加了工业化的成本；CN102485742A中公开的制备PEG-rhG-CSF的方法，在制备开始时使用磷酸盐缓冲液液，在反应结束时加入胱氨酸终止反应，并且在纯化过程中需要使用梯度洗脱。

发明内容

本发明提供了一种聚乙二醇衍生化的重组人粒细胞刺激因子的制备方法及其药物组合物。

本发明通过如下技术方案实现：

一种制备聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)通过碱调节剂调节含有重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)的母液pH至第一pH；

(b)母液中加入甲氧基-聚乙二醇-丙醛(mPEG-PAL)，搅拌溶解；

(c)加入NaBH₃CN，搅拌反应；

(d)通过酸调节剂调节反应液pH至第二pH终止反应，得聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子；

所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子为重组人粒细胞刺激因子N端与聚乙二醇以1:1共价结合。

所述碱调节剂优选地为无机碱或其溶液；更优选地为NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃，或其溶液；进一步优选地为NaOH、Na₂CO₃或其溶液；最优选地为NaOH或其溶液。碱调节剂最优选地为NaOH或其溶液是为了减少在反应体系中引入其他物质，更大程度地提高产品质量，选择其他调节剂并不影响发明技术方案的实现。

所述酸调节剂优选地为无机酸或有机酸或其溶液；更优选地为盐酸、硫酸、硝酸、磺酸等或其溶液；进一步优选地为盐酸溶液、醋酸、醋酸溶液；最优选地为盐酸溶液。酸调节剂最优选地为盐酸溶液是为了减少在反应体系中引入其他物质，更大程度地提高产品质量，选择其他调节剂并不影响发明技术方案的实现。

优选地所述第一pH为5～7；优选地所述第二pH为3～4。

优选地所述甲氧基-聚乙二醇-丙醛的分子量为8千道尔顿～22千道尔顿；更优选地为19千道尔顿～21千道尔顿。

所述含有重组人粒细胞刺激因子的母液中含有18～22mmol/LNaAc和45～55mmol/LNaCl。优选地NaAc浓度为约20mmol/L。优选地NaCl浓度为约50mmol/L。优选地母液中重组人粒细胞刺激因子的浓度为0.5～2.5g/L，更优选地为0.5～1.5g/L，进一步优选为约1g/L。