[发明专利]一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法及其药物组合物

权利要求书

1.一种制备聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的方法，包括如下步骤：

(a)通过碱调节剂调节含有重组人粒细胞刺激因子的母液pH至第一pH；

(b)母液中加入甲氧基-聚乙二醇-丙醛，搅拌溶解；

(c)加入NaBH₃CN，搅拌反应；

(d)通过酸调节剂调节反应液pH至第二pH终止反应，得所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子；

所述第一pH为5～7；所述第二pH为3～4；

所述甲氧基-聚乙二醇-丙醛的分子量为8千道尔顿～22千道尔顿；

所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子为重组人粒细胞刺激因子N端与聚乙二醇以1:1共价结合；

所述碱调节剂优选地为无机碱或其溶液；更优选地为NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃，或其溶液；进一步优选地为NaOH、Na₂CO₃，或其溶液；最优选地为NaOH或其溶液；

所述酸调节剂优选地为无机酸或有机酸或其溶液；更优选地为盐酸、硫酸、硝酸、磺酸等或其溶液；进一步优选地为盐酸溶液、醋酸、醋酸溶液；最优选地为盐酸溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述含有重组人粒细胞刺激因子的母液中含有18～22mmol/LNaAc和45～55mmol/LNaCl，重组人粒细胞刺激因子的浓度为0.5～2.5g/L，优选NaAc的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为50mmol/L，重组人粒细胞刺激因子的浓度为0.5～1.5g/L，更优选重组人粒细胞刺激因子的浓度为1g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中加入的甲氧基-聚乙二醇-丙醛与步骤(a)中含有重组人粒细胞刺激因子的母液中所含有的重组人粒细胞刺激因子的质量比为(4～11)：1，优选为(6.5～11)：1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)中加入NaBH3CN后，反应液中NaBH3CN的浓度为10～35mmol/L。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)加入NaBH3CN后，反应时间为10～24小时。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)～步骤(d)的温度为4～25℃。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述甲氧基-聚乙二醇-丙醛的分子量为19千道尔顿～21千道尔顿；所述重组人粒细胞刺激因子的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，还包括如下纯化聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化步骤：

采用琼脂糖凝胶层析柱进行纯化，步骤(d)中的反应液上样后，通过平衡液进行平衡，然后通过洗脱液洗脱获得聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子。

9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为阳离子琼脂糖凝胶；所述平衡液为含有18～22mmol/LNaAc和145～155mmol/LNaCl的水溶液，优选为含有20mmol/LNaAc和150mmol/LNaCl的水溶液；所述洗脱液为含有18～22mmol/LNaAc和195～205mmol/LNaCl的水溶液，优选为含有20mmol/LNaAc和200mmol/LNaCl的水溶液；阳离子琼脂糖凝胶优选地为SPSepharose；阳离子琼脂糖凝胶更优选地为SPSepharoseFF。

10.一种药物组合物，由权利要求1-8任一项所述制备方法获得的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子以及注射用水、醋酸、山梨醇、吐温20和NaOH组成，每1L溶液中含有0.55～0.61g醋酸、47.5～52.5g山梨醇、0.031～0.035g吐温20和以重组人粒细胞刺激因子计为9.5～10.5g的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，且含有NaOH的量使得溶液的pH为3.5-4.5，优选为4。