[发明专利]一种利用氢气提高白桦细胞中总三萜和白桦脂醇含量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及氢气促进次生代谢物的合成，它属于生物工程技术领域。

背景技术：

氢是自然界广泛存在且分子结构最简单的元素，宇宙中90％的成分是由氢组成的。氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。在潜水医学领域，氢气被广泛应用于高深入的氢氧混合潜水过程中。氢气的溶解度比较低，且不能被机体大量吸收，所以，人们一直没有重视氢在高等生物体内的作用。氢气的还原性是氢气最重要的化学性质，我们在中学就学习过，氢气可以还原加热氧化铜为铜。但是许多人并不知道，氢气还具有独特的生物学特征，过去生物学领域一直认为氢气属于生理性惰性气体，认为氢气是没有任何生物学效应的气体。但是自2007年国际著名杂志《Nature Medicine》报道，氢气具有神奇的选择性抗氧化作用，患者只需要呼吸35min浓度为2％的氢气，就可以非常有效地治疗脑缺血再灌注损伤。呼吸氢气也可以治疗新生儿脑缺血缺氧后脑病。随后，氢气在植物学、基础医学和临床转化研究方面成为新的研究热点。认为氢气的巨大应用潜力还没有真正得到认识。

到目前为止，国际上关于氢气生物医学的研究论文已经接近500篇，平均2天就增加1篇。由于氢气在医学上没有可以借鉴的领域，作为一种治疗性气体，目前最有效的方式是通过饮用氢气饱和水，临床应用可以通过呼吸氢气氧气混合气体和注射氢气饱和溶液。

实验表明氢水，H₂吸入，和腹膜内、静脉内注射氢的饱和盐水对活性氧引起的疾病都具有保护作用。这些研究中所积累的证据表明，H₂可以保护各种细胞，组织和器官免受氧化损伤。在细菌和藻类中H₂的代谢已经进行了许多调查。一些早期的研究表明在一些高等植物中H₂演变和吸收发光的树叶和假设存在的氢化酶。然而，在高等植物中很少有研究审查制氢的生理作用和支持这一进程的机制。

近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生代谢物质的研究取得了很大的进展，如紫草细胞生产紫草素、人参细胞培养生产皂甙、洋地黄细胞培养生产生物碱等都达到工业化的生产规模，用长春花细胞培养生产抗癌生物碱已经达到了中试水平(刘春朝等，1997；胡立勇，2004)。然而次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养植物天然产物技术产业化应用的核心问题之一，理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基础。虽然，国内外研究者针对植物培养细胞中次生代谢物低产问题进行了研究，包括优质细胞系的选育、培养条件的优化、培养技术改进以及活性物质合成关键酶基因的克隆等(郭肖红等，2005；徐茂军，2009；钱丹丹等，2011)。但到目前为止，植物细胞中次生代谢物的低产问题仍未得到很好的解决。

白桦(Betula platyphylla suk)树叶和树皮中含有重要的次生代谢产物---白桦三萜(TBP)，主要类型包括羽扇豆烷型、达玛烷型、齐墩果烷型三萜物质(Zhang，2003)，是极具开发潜力的抗癌、治疗心血管疾病、护肝的先锋药物(李薇，2000；叶银英，2000，2001)。与初生代谢相比,植物次生代谢具有非常强的可调控性。针对植物培养细胞中天然活性物质的低产问题,国内外研究者进行了大量的研究探索。研究探讨植物细胞中与次生代谢产物合成有关的机制不但有助于掌握植物次生代谢的调控规律而且对生产实践中解决植物培养细胞次生产物低产问题具有重要意义。针对能促进白桦三萜合成的作用,研究其调控白桦悬浮培养细胞中三萜合成的分子机制，重点探讨H₂诱导对三萜合成的影响等，建立氢气调控白桦三萜合成的技术体系，为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问题提供可靠而稳定的技术。

本发明的内容：

为保护白桦自然资源，建立可持续开发利用的资源生产程序，利用无毒无害的氢气诱导来自白桦诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞，进行总三萜和白桦脂醇的合成与生产，同时利用高效液相色谱法进行定量检测。为进行工业化法大规模生产总三萜和白桦脂醇类药物的提供了新方法。

实施方案：

(1)悬浮细胞的培养

在超净工作台上，切下腋芽，用70％酒精浸泡5min，再用5％的次氯酸钠溶液消毒10-20min，然后放于已灭菌的培养皿中，接种到预先经过高温高压灭菌的各种组合的培养基上(NT+1.0mg/L水解酪蛋白+3％蔗糖+0.5～4.0mg/LBA,0.2～4.0mg/L NAA)进行愈伤组织的诱导。每瓶接种大约3-5个腋芽。先用暗培养一周后进行光培养。培养约7周后，获得愈伤组织。愈伤组织经过继代培养后，迅速增殖。