[发明专利]棉花杂交种亲子鉴定方法

权利要求书

1.一种棉花杂交种亲子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分别提取亲本棉花以及待测棉花杂交种籽粒样品中的DNA；

2)分别以步骤1)中提取的DNA为模板，利用用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组合进行PCR扩增反应；

3)分析亲本及杂交种的PCR扩增产物；

所述用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组合，由下列引物对组成：

NAU3254-F和NAU3254-R、NAU2277-F和NAU2277-R、NAU1190-F和NAU1190-R、NAU1071-F和NAU1071-R、MUCS101-F和MUCS101-R、NAU934-F和NAU934-R、NAU1200-F和NAU1200-R、NAU874-F和NAU874-R、NAU905-F和NAU905-R、NAU1362-F和NAU1362-R、BNL3257-F和BNL3257-R、BNL1317-F和BNL1317-R、BNL2960-F和BNL2960-R、BNL1231-F和BNL1231-R、BNL3442-F和BNL3442-R、BNL3261-F和BNL3261-R、BNL1421-F和BNL1421-R、BNL2449-F和BNL2449-R、CIR246-F和CIR246-R、NAU2437-F和NAU2437-R、BNL830-F和BNL830-R、JESPR292-F和JESPR292-R、NAU1167-F和NAU1167-R、NAU1028-F和NAU1028-R、CIR216-F和CIR216-R、NAU3110-F和NAU3110-R、BNL3646-F和BNL3646-R、BNL3171-F和BNL3171-R、NAU1103-F和NAU1103-R、BNL4030-F和BNL4030-R、BNL3140-F和BNL3140-R、JESPR110-F和JESPR110-R、NAU1125-F和NAU1125-R、BNL827-F和BNL827-R、NAU3588-F和NAU3588-R、CIR170-F和CIR170-R，其中，F表示上游引物，R表示下游引物；上述引物对的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-72所示；

步骤3)中分析PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过银染检测，对棉花亲本样品与待测杂交种样品的36个位点的DNA指纹谱带进行比对分析：

亲权排除位点数≥2，判定待测杂交种与亲本无亲子关系；

0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≥2，判定待测杂交种与亲本存在亲子关系；

0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≤1，判定待测杂交种为亲本或近似亲本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs 0.8μl，20μM上、下游引物各0.15μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，共30个循环；72℃7分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。