[发明专利]一种山油柑碱的提取分离方法与应用

说明书

技术领域

 本发明涉及一种山油柑碱的提取分离方法与应用，具体是涉及一种应用高速逆流色谱技术从山油柑根中分离纯化山油柑碱的方法，还涉及山油柑碱在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

山油柑碱（Acronycine），分子式C₂₀H₁₉NO₃，分子量321.36，难溶于水，可溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

山油柑碱是从芸香科植物山油柑 Acronychia pedunculata (L.)Miq.根中提取分离的一种生物碱类化合物。实验研究表明，山油柑碱具有能抑制细胞的有丝分裂和降低吉田腹水瘤细胞分裂指数。能影响癌细胞核酸的生成，显著降低L615小鼠脾中RNA的含量，而对正常动物组织中RNA和DNA的含量无显著影响。抗动物癌谱较广， 在17种瘤谱中，对其中12种瘤谱有显著抑制作用，对目前临床使用的化疗药物不敏感的髓性白血病C-1498，浆细胞骨髓瘤X-5563(接近人体肿瘤)和Shingi癌-115均有抑制作用。

现有提取山油柑碱的报道并不多见，市场上也尚未有山油柑碱对照品的出售，因此提供一种山油柑碱的提取分离方法与应用则很有必要，可以为其后续研究提供支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种山油柑碱的提取分离方法与应用，本发明方法制得的山油柑碱质量好，纯度高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种山油柑碱的提取分离方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取：将山油柑根粉碎，加入7-12倍药材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混悬20-40min，进行负压空化混悬固液萃取1-2次，得到萃取液；

（2）大孔树脂富集：萃取液回收乙醇得总生物碱浸膏，加入大孔树脂，拌匀、干燥后装柱，醇水溶液洗脱，收集山油柑碱流分，浓缩得山油柑碱粗品；

（3）纯化：将上述粗品采用高速逆流色谱法分离纯化，以氯仿-甲醇-水为两相溶剂系统，ELSD检测器监测，收集目标流分，回收试剂，真空干燥得产品。

步骤（1）所述乙醇水溶液浓度为75%，用量为10倍药材重量。

步骤（1）所述混悬时间为30min，萃取2次。

步骤（2）所述萃取液浓缩至密度1.1-1.2g/ml。

步骤（2）所述大孔树脂为D101型，醇水溶液为85%的乙醇溶液。

步骤（3）所述氯仿-甲醇-水体积比为（5-9）:（15-17）:（6-8）。

本发明提取分离方法制得的化合物在抗肿瘤药物中的应用。

本发明提取分离方法制得的化合物进行抗肿瘤活性实验表明：该化合物具有较强的抗肿瘤活性，在天然新药开发中具有良好的应用前景。

本发明提取分离方法制得的山油柑碱采用MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）进行抗肿瘤活性测试。

试验用细胞株：

HeLa：人子宫颈癌细胞株；HEC-1：人子宫内膜癌细胞株；T-98和U251-SP：人脑神经胶质瘤细胞株；HLE：人肝癌细胞株；MM1-CB和HMV-1：人黑色素瘤细胞株。

方法：（1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3平行孔。37℃，5%CO 2 、95%空气的培养箱中预培养24h，弃上清。

（2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂为有二甲亚砜和水)，为10 ^-4 mol/L。

（3）细胞连续培养48h，每孔加入10μl 5mg/ml的 MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。

（4）吸去上清。加入200μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。

（5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100% 

实验结果：本发明化合物的抑制率以相对于对照（添加DMSO）的结果如下表1：

表1 山油柑碱的肿瘤细胞增值抑制率%