[发明专利]一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器微载体悬浮培养技术大规模高密度生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

目前，猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)疫苗抗原生产主要采用细胞转瓶培养方法，少数采用细胞悬浮培养方法，转瓶工艺生产半成品抗原病毒含量较低，仅为10^4.5～6.0TCID₅₀/ml，不能提供稳定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≥10^5.5TCID₅₀)，需要进行高倍浓缩。且转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要10天；效率较低，每次培养只能收获一次；培养基中含有一定浓度的牛血清，抗原杂蛋白比较多，易造成应激反应；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和GMP厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响疫苗质量的稳定性；转瓶清洗需要大量水，并且产生的含毒废水需要专门处理，容易对环境造成污染，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。而普通细胞微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，但仍存在较大改进空间，传统微载体悬浮培养工艺，其生产周期仍需6～7天，且每次培养只能收获1次；仍依靠转瓶提供带毒细胞，无法避免转瓶清洗产生的带毒废水，另传统转瓶工艺及传统反应器微载体悬浮培养工艺，其生产的抗原中存在较高含量的血清，所产疫苗，会使动物机体产生不同程度的不良反应。

发明内容

本发明的目的在于克服现有转瓶培养法及传统细胞悬浮微载体培养法的不足之处，提供一种应用反应器微载体悬浮培养技术大规模高密度生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本和提高产量，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％～90％，生产周期减少7天，产量提高3～10倍；较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低40％～50％，产量提高3～5倍，因为其可以收获抗原多次。且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。

为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：

一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：

(1)种子细胞的制备将无菌生理盐水预热处理，使用预热后的生理盐水洗涤长满单层的健康克隆细胞PK-15W作为种细胞，加入20～40ml胰酶进行消化，消化期间，时刻观察细胞层变化，待细胞层呈白色雾状并部分脱落时，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的细胞生长液，种子细胞终止消化，迅速摇动转瓶，使壁上细胞脱落，反复吹打分散细胞后，按照1:3至1:5的传代比例分瓶；

(2)制苗细胞的制备根据最终培养体积称取Cytodex-1微载体，使其终浓度为5～10g/L，用PBS进行浸泡清洗，灭菌后，在搅拌式生物反应器中使用细胞生长液进行平衡，备用；选取生长状态良好的种子细胞接种生物反应器，接种密度为1～5×10⁵个/ml；

(3)接毒随后，以最终培养体积的3％～8％接种PCV2种毒；接种后，设定反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为80～120r/min；

(4)病毒的收获和含量测定待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养48～72h后静置，排出上清，加入含有伴刀豆球蛋白A和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM细胞维持液，调整反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min，继续维持48～72h后静置，进行第一次上清收获，观察细胞状态，如细胞状态良好则补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min的条件下继续培养48～72h后静置，进行第二次上清收获，重复此过程直至微载体上的细胞全部脱落，结束整个培养过程，收获上清后，将微载体进行回收处理，并将收获的抗原反复冻融3次后作为半成品，进行病毒含量测定。

(5)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗。

(6)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗的方法，包括：将PCV2株在PK-15W细胞中大量增殖，经甲醛灭活后加入常用佐剂进行乳化，制备常规的佐剂疫苗。

具体实施方式