[发明专利]一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法

权利要求书

1.一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：

(1)种子细胞的制备将无菌生理盐水预热处理，使用预热后的生理盐水洗涤长满单层的健康克隆细胞PK-15W作为种细胞，加入20～40ml胰酶进行消化，消化期间，时刻观察细胞层变化，待细胞层呈白色雾状并部分脱落时，加入含有伴刀豆球蛋白A和D-氨基葡萄糖的有血清低糖DMEM的细胞生长液，种子细胞终止消化，迅速摇动转瓶，使壁上细胞脱落，反复吹打分散细胞后，按照1:3至1:5的传代比例分瓶；

(2)制苗细胞的制备根据最终培养体积称取Cytodex-1微载体，使其终浓度为5～10g/L，用PBS进行浸泡清洗，灭菌后，在搅拌式生物反应器中使用细胞生长液进行平衡，备用；选取生长状态良好的种子细胞接种生物反应器，接种密度为1～5×10⁵个/ml；

(3)接毒随后，以最终培养体积的3％～8％接种PCV2种毒；接种后，设定反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为80～120r/min；

(4)病毒的收获和含量测定待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养48～72h后静置，排出上清，加入含有伴刀豆蛋白A和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM细胞维持液，调整反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min，继续维持48～72h后静置，进行第一次上清收获，观察细胞状态，如细胞状态良好则补加与收获上清等量的新鲜细胞维持液，在pH7.0～7.4，DO为20％～80％，搅拌速度为100r/min～180r/min的条件下继续培养48～72h后静置，进行第二次上清收获，重复此过程直至微载体上的细胞全部脱落，结束整个培养过程，收获上清后，将微载体进行回收处理，并将收获的抗原反复冻融3次后作为半成品，测定其病毒含量。

2.用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗。

3.用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗的方法，包括：将PCV2株在PK-15W细胞中大量增殖，经甲醛灭活加入佐剂进行乳化，制备疫苗。

4.根据权利要求1所述的一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，其特征在于：所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM 89％～94％，NBCS 5％～10％，双抗1％。

5.根据权利要求1所述的一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，其特征在于制苗细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM为85％～92％，NBCS 5％～10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖0.5％～2％，伴刀豆蛋白A 0.5％～2％。

6.根据权利要求1所述的一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法，其特征在于：所述制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM95％～98％，伴刀豆蛋白A0.5％～2％，水解酪蛋白0.5％～2％，双抗1％。