[发明专利]一种解淀粉芽孢杆菌胞外抗菌脂肽的提取方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物代谢产物及其应用技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌胞外抗菌脂肽的提取方法及应用。

背景技术

微生物杀菌剂的特性与发展趋势与人类生态环境、食品安全、生物多样性等具有良好的相容性，加上现代微生物工业化生产技术体系日趋完善，微生物杀菌剂的研发已经成为热点。微生物杀菌剂目前在我国应用较多的主要是作为微生物农药进行植物病害防治。由于芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又是自然界中广泛存在的非致病菌，对人畜无害、环境安全，因而备受关注，其中解淀粉芽孢杆菌是重要的生物防止细菌之一。

Caldelra等分离到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCMI1051对根霉(Rhizopussp)L-122和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)CCMI783等具有强烈的抑制作用。Arrebola等报道解淀粉芽孢杆菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉属真菌的菌丝延伸；Sutyak等人从酸奶厂的益生菌乳制品中分离出1株解淀粉芽孢杆菌，其培养物上清对李斯特菌(Listeria monocytogenes)、阴道加德纳菌和无乳链球菌有抑制效果，其有效抑菌物质为细菌素。研究表明：芽孢杆菌及其产生的抑菌物质在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力。

王英国等人从堆肥中分离到一株解淀粉芽孢杆菌，其对于尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。李潞滨等人从各地大花惠兰种植地采集的土样中筛选出对大花惠兰根腐病病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌ZL725。王奕文等人首次从不同甜瓜果实表面分离到一株解淀粉芽孢杆菌，对灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、黑曲霉和粉红单端孢等8种果蔬采后病原真菌显著且广谱的拮抗作用。姜军坡等人从健康牛的粪便中筛选出对大肠杆菌有抑制作用的解淀粉芽孢杆菌BN-9。陈士云等分离的解淀粉芽孢杆菌CH-2对油菜核盘菌具有显著的抑菌作用，可抑制菌丝进一步形成菌核的能力。刘俏等分离的解淀粉芽孢杆菌能强烈一只镰刀菌、曲霉、青霉、毛霉等食品腐败真菌。

芽孢杆菌属(Bacillus spp.)细菌可产生多种抗菌类活性物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等，对多种动物、植物及人类病原菌又很好的抑制作用，同时芽孢杆菌还可产生胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，因此被广泛用于医药、食品、化妆品、饲料加工、农药、环境保护等行业。

芽孢杆菌产生的抗菌物质主要有小分子的抗生素和大分子的拮抗蛋白或细胞壁降解酶类两大类物质。孙立军等从解淀粉芽孢杆菌ES-2中分离出一系列抗菌脂肽具有抗细菌、真菌、病毒、支原体的功能及良好的表面活性作用。Romano等从解淀粉芽孢杆菌BO5A中分离出的环状脂肽对尖孢镰刀菌、黑曲霉、葡萄贵腐霉、青霉具有很好的抑制作用。Arias等从解淀粉芽孢杆菌GA1中分离出的一菌脂肽对革兰氏阳性菌有特异的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外抗菌脂肽的提取方法及应用，该抗菌脂肽具有良好的抑菌效果，为探寻新型生物抗菌类物质开拓了新思路及新研究领域。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种解淀粉芽孢杆菌胞外抗菌脂肽的提取方法，包括以下步骤：

1)将解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1单菌落接种在LB液体培养基中，在20～40℃下培养过夜；然后转接至种子培养基中，在20～40℃下培养5h，再转接至发酵培养基中，在20～40℃下培养36～72h；其中种子培养基和发酵培养基是在LB液体培养基中添加质量分数为0.5～5％的葡萄糖或蔗糖作为附加碳源；

2)培养完成后，离心，收集培养液上清；

3)将培养液上清依次经酸沉淀、冻干后得到解淀粉芽孢杆菌胞外抗菌脂肽。

所述步骤1)的具体步骤是将解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1单菌落接种在LB液体培养基中，在20～40℃下、150～250rpm恒温摇床中培养过夜，得到培养物；然后按照1～3％的转接量将培养物转接至种子培养基中，在20～40℃下、150～250rpm恒温摇床中培养5h，得到种子培养物；再按1～3％的转接量将种子培养物转接至发酵培养基中，在20～40℃下、150～250rpm恒温箱中培养36～72h。