[发明专利]一种小核糖核酸的电化学检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及小核糖核酸检测技术领域，特别涉及一种对痕量小核糖核酸的电化学单分子检测方法。

背景技术

microRNA(微小RNA)是一类长度约为21～25个核苷酸的小分子RNA，通过与mRNA(信使RNA)互补结合，在转录后水平抑制靶基因的表达microRNA普遍存在于多细胞生物中，而且数量可观，约占整个基因组基因总数2％左右。microRNA在生物进化过程中高度保守，并已被证实参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程，以及包括肺癌、白血病在内的多种疾病发生过程。研发人员监测大量已知microRNA在免疫反应中表达的变化，从而发现其在生理病理状态下的重要作用。除此之外研发人员还可以发现和鉴定出新的生物标志物，从而达到监测免疫细胞的信号转导和组织器官的分化的目的。由于microRNA细胞特异性以及“时空”特异性的特点，近年来其在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现。通过监测大量已知microRNA在免疫反应中表达的变化，研发人员可以在较短的时间内发现新的干细胞分化的标志microRNA；此外通过对已知的microRNA标志物表达量的检测，可以达到对干细胞的多能性以及分化进行监测的目的。根据国内外的相关报告，某些microRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。根据microRNA在人体中起到的调节蛋白生成的特殊作用，我们认为其在未来临床检测应用方面具有广阔的前景。

现在常见的检测靶标microRNA的方法有深度测序(Deep Sequencing)基因芯片(Micro-Array)、实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)等。

上述方法大多需要大型、较昂贵设备的支持，检测成本较高，不适合常规的分析检测，因此需要发展一种简单、成本低又灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单的检测靶标微小RNA的方法。本发明所述电化学单分子检测方法是一种非常简便的分析方法，通过三电极系统中电信号的变化可以直接判断出待测样品中是否存在靶标微小RNA，操作简单，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对靶标微小RNA的检测。

本发明提供一种靶标微小RNA的电化学单分子检测方法，包括以下步骤：

步骤一 固定在工作电极表面的报告DNA与阻塞DNA形成双链a，打开报告DNA的茎环结构；

步骤二 靶标microRNA与双链a中的阻塞DNA结合，形成双链b，使阻塞DNA从工作电极表面脱离，报告DNA自发形成茎环结构；

步骤三 引物DNA与双链b中阻塞DNA末端序列结合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA双链c，同时将靶标microRNA置换下来；

步骤四 被置换下来的靶标microRNA又重新回到工作电极表面，与其他的工作电极表面的双链a发生反应；

步骤五 经过上述N次循环反应后，工作电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，工作电极表面电信号会越来越强，从而实现对单分子微小RNA的电化学单分子检测。

优选的，所述报告DNA5′端带有可以修饰到电极表面的基团(如巯基，氨基等)，报告DNA3′端带有电信号分子。

优选的，所述阻塞DNA通过与报告DNA互补配对被固定与电极表面，

但不是直接连接与工作电极表面。

优选的，所述阻塞DNA上有一段可以与靶标微小RNA配对的碱基序列。

优选的，靶标microRNA是可以重复利用的。

优选的，所述报告DNA与阻塞DNA形成双链a时，报告DNA3′端电信号分子远离金电极表面，电信号减弱。

优选的，所述报告DNA在单分子链状态下形成茎环结构时报告DNA3′端带有电信号分子，靠近工作电极表面，增强电信号。