[发明专利]一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物寄生线虫检疫鉴定领域，提供了一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，具体而言，所述方法通过使用新的DNA提取裂解液，极大地简化了植物寄生线虫基因组DNA提取程序，显著提高了DNA提取效率和成功率，有效地解决了以前植物寄生线虫DNA微量提取过程中存在的效率低、稳定性差、不易操作、步骤繁多等问题，适用于口岸及农林业相关检疫鉴定实验室应用。

背景技术

传统的植物线虫鉴定方法主要依赖于形态特征和形态测量值，要求鉴定者要有极为丰富的经验和技巧。基于DNA的分子鉴定方法对鉴定者的要求相对较低，是形态鉴定的重要辅助手段，目前在线虫的分类鉴定中应用广泛。线虫分子鉴定的首要步骤是DNA的提取，通常来说包括线虫DNA大量提取和线虫DNA微量提取两种方法。而其中线虫DNA微量提取方法因其需要线虫量少、无需线虫纯化，同时具有简捷、廉价等优点，因而在线虫分子鉴定中备受青睐。

关于线虫DNA微量提取方法有较多的研究报道。Barstead等(1991)和Williams等(1992)使用WLB裂解液成功提取了单条秀丽小杆线虫的DNA，也是目前能够追溯的最早建立的线虫DNA微量提取方法。Stanton等(1998)以根结线虫的二龄幼虫为材料，系统比较了微波加热法、水浴加热法、蛋白酶裂解法、直接磨碎法和NaOH法提取线虫DNA的效果，发现NaOH法提取成功率可达81％，直接磨碎法成功率为50％，其它方法效率较低。沈锡权等(2005)从单条固定海洋线虫中提取得到基因组DNA，并用于18S rRNA基因PCR扩增，发现蛋白酶K法获得的DNA比NaOH裂解法所获得的更适合PCR扩增。2011年，王江岭等提出使用液氮替代-80℃冰箱冷冻线虫，进一步提高了单条线虫DNA提取的效率，可高效、稳定的提取滑刃类线虫的DNA，但提取短体线虫时效果较差。王金成等(2012)对王江岭等建立的方法进行了再次改进，解决了单条短体线虫DNA微量提取问题。

虽然线虫DNA微量提取的方法很多，但大多数方法因操作复杂、步骤繁多或效率不高、稳定性不够等原因被淘汰，只有酶裂解法被广泛应用。但实践表明，酶裂解法的效率和稳定性仍然需要优化提高，操作步骤需要进一步简化，以适合更加多样的线虫DNA的提取。本研究以相对成熟的一种酶裂解法为基础，对其关键试剂——裂解液的组份和浓度进行了系统性的筛选和优化，以提出一种更加高效、稳定、廉价、简捷的线虫DNA微量提取方法，为植物寄生线虫的检疫鉴定提供部分技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有植物寄生线虫基因组DNA微量提取技术中存在的效率低、成功率低、步骤繁杂等缺陷，提供一种用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的裂解液及其应用，所述裂解液如下：

所述裂解液的配方包含：

10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl₂，60mM KCl，10mg/mL TritonX-100(即曲拉通X-100)，0.2mM DTT(即二硫代苏糖醇)和300μg/mL Proteinase K(即蛋白酶K)。

进一步地，本申请提供一种上述裂解液的制备方法，其特征在于：

所述裂解液由10×PCR Buffer(含15mM的Mg²⁺)、100mM的KCl溶液、100mg/mL的TritonX-100溶液、3000μg/mL的Proteinase K溶液、1mM的DTT溶液和双蒸水按1∶1∶1∶1∶2∶4的体积比混合配制而成。

进一步地，本发明涉及一种将上述裂解液用于植物寄生线虫基因组DNA微量提取的应用，其特征在于：

首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含5～20μL所述裂解液的PCR管中，最后56℃保温0.5～4h，95℃加热10min。经上述步骤提取获得的上清液即可用于分子实验。

优选地，裂解液的使用量为10～15μL，56℃保温的时间为1～3h。

本申请的裂解液适用于多种植物线虫的基因组DNA微量提取，特别地，适用于穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、斯氏短体线虫(Pratylenchus scribneri)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)。

所述双蒸水即为经过两次蒸馏的无菌水，其通常用于分子生物学实验。