[发明专利]动物血、脑样品中痕量烟碱及其主要代谢物的同步分析方法

说明书

技术领域

    本发明涉及动物血、脑样品中痕量烟碱及其主要代谢物的同步分析方法，本方法针对动物微透析液样品，以稳定同位素标记物作为内标物，利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对样品中痕量烟碱及可替宁进行检测，揭示烟碱在动物体内的代谢规律。

背景技术

烟碱（Nicotine, NIC）是烟草的重要特征成分。由吸烟所导致的烟碱依赖，是持续吸烟进而危害健康的深层次原因。烟碱依赖的发生与个体对烟碱的代谢密切相关。研究烟碱在体内尤其是中枢神经系统内的代谢特征，可为烟碱依赖的形成机理提供依据。

大多数情况下，烟碱在体内可代谢为9种化合物。其中，大部分的烟碱通过C-氧化代谢为可替宁（Cotinine，COT）。因此，烟碱及其主要代谢物可替宁可作为衡量机体烟气暴露程度的生物标志物，用来区分吸烟者和非吸烟者。目前，关于这方面的研究已成为环境与健康领域中的热点。

目前国内外关于烟碱代谢的报道中所采用的分析方法有气相色谱-质谱（GC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法、液相色谱-串联质谱（LC-MSⁿ）法等。近年来，HPLC-MSⁿ尤其是UPLC-MSⁿ在生物样品分析方面具有很大的优势，已经成为烟碱及其代谢物分析的重要手段[参考文献1：Maria Dobrinas, Eva Choong, Muriel Noetzli, Jacques Cornuz, Nicolas Ansermot, Chin B. Eap. Quantification of nicotine, cotinine, trans-3’-hydroxycotinine and varenicline in human plasma by a sensitive and specific UPLC-tandem mass-spectrometry procedure for a clinical study on smoking cessation. Journal of Chromatography B, 2011, 879: 3574-3582. 参考文献2：Koen De Cremer, Ilse Van Overmeire, Joris Van Loco. On-line solid-phase extraction with ultra performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry for the detection of nicotine, cotinine and trans-3’-hydroxycotinine in urine to strengthen human biomonitoring and smoking cessation studies. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2013, 76: 126-133.]。然而，这些研究也存在一定的不足，比如仅注重采集外周系统中单一位点样品进行分析测定，较少研究烟碱在其靶器官——脑组织内的代谢特征；而且，收集到的生物样品都属于复杂基质样品，分析检测时往往需要进行沉淀蛋白、离心、纯化等前处理步骤，不仅操作繁琐，还影响了定量分析的准确性。最近，微透析技术的发展体现出了很大的优势[参考文献3：Yuh-Lih Chang, Pi-Lo Tsai, Yueh-Ching Chou, et al. Simultaneous determination of nicotine and its metabolite, cotinine, in rat blood and brain tissue using microdialysis coupled with liquid chromatography: pharmacokinetic application[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1088: 152-157. 参考文献4：Anna Czubak, Elzbieta Nowakowska, Krystyna Golembiowska, et al. Effect of venlafaxine and nicotine on the level of neurotransmitters and their metabolites in rat brains. Journal of Physiology and Pharmacology, 2010, 61(3): 339-346.]。利用微透析技术不仅可以实现多位点样品的同步、动态收集，而且样品中还不含蛋白质，可以实现直接进样分析。生物样品中烟碱及其代谢物的含量仅为ng级甚至更低，采用微透析样品进行LC-MSⁿ分析，可以极大地消减基质效应，同时选用同位素标记物作为内标物，还可以提高定量分析的准确度。