[发明专利]一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2基因的筛选试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂盒及方法。

背景技术

DREB2s(Dehydration Responsive Element Binding Protein2)是一类植物特有的转录因子，隶属于AP2/EREBP转录因子家族，在植物逆境信号转导途径中有重要作用。Liu等和Kasuga等首次从拟南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.]中克隆得到了DREB2A转录因子，发现其与干旱应答元件CRT/DRE(C-Repeat/Dehydration-Responsive Element，核心序列：A/GCCGAC)或GCC-BOX(核心序列：TAGCCGCCA)特异性结合，参与调控干旱、高盐和低温等耐性相关基因的表达，在植物的非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。在GenBank数据库注册的编码DREB2s序列涉及20多个物种，这其中包括模式植物、重要的大田作物和旱盐胁迫生境条件下生长的植物，目前人们更热衷于在逆境适应性强的植物材料中挖掘新的DREB2基因，DREB2s基因功能及调控机制的研究则主要以模式植物拟南芥为研究对象。DREB2s促使下游含DRE元件的胁迫诱导基因发挥作用，使植物的抗逆性得到综合改良。Qin等将玉米ZmDREB2A转化到拟南芥，发现其过量表达能够激活下游HSPs和HsfA3等热激相关基因的表达，转ZmDREB2A植物的耐旱和耐热性提高。PgDREB2A可以增加转基因烟草的耐盐和抗旱性，并且在渗透胁迫和热胁迫条件可以上调下游基因，转PgDREB2A烟草耐盐性、抗热性显著提高，而T0代种子产量和植株表型与野生型无异。但是，植物中过量表达有些来源的DREB2s，在提高植株抗逆性的同时，会对植物产生一定的毒害作用，导致转基因植物生长迟缓，影响植物的生长发育，表现为生长的延迟及植株的矮化。Sakuma等对转基因植株生长迟缓原因研究时发现，使用诱导型启动子RD29A可以避免AtDREB2A过量表达引起的生长迟缓。35S:AtDREB2A CA转基因植株生长矮化，而且矮化程度与AtDREB2A CA和其下游功能基因RD29A的表达水平成正比，而转全长基因的35S:AtDREB2A FL转基因植株的生长矮化现象不明显。

高羊茅(Festuca arundinacea＝Lolium arundinaceum)是禾本科羊茅属多年生草本植物，是我国目前使用量增长最快的草种，在我国大部分地区可以栽培，是南方地区绿期最长的冷季型草坪。高羊茅的夏季生长需水量较大，夏季干旱和高温环境条件是限制其生长的主要因素。提高环境的适应性，培育节水、耐旱抗高温型品种是目前高羊茅育种的主要目标之一。植物抗逆性状非常复杂，往往与数量性状位点连锁，而高羊茅的遗传背景复杂(PPG1G2G3G4，2n＝6x＝42)，基因组较大(5.27～5.83×10⁶kb)，且为种子繁殖为主的异花授粉植物，采用传统的选择育种获得的品种(品系)多为异质杂合群体，选育周期长，性状不稳定，获得优良抗性品种十分困难。随着植物分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，利用基因工程技术改良高羊茅性状成为可能。DREB2s转录因子可调控下游大量逆境胁迫基因的表达，利用该转录因子有望综合改良植物的抗逆性。因此，对具有产业化潜力的DREB2转录因子进行基因功能和抗逆调控机制研究，利用它们改造高羊茅，将有助于高羊茅等草坪植物的抗逆基因工程育种。

与转录组学研究的方法(基因芯片技术、SAGE技术和MPSS技术、EST技术、高密度全基因组芯片)相比，RNA-Seq技术是全新的转录组研究方法，可对任意物种的整体转录活动进行检测，用序列片段的数量表示基因的转录水平，能够检测可变剪接和新基因，对转录体结构的分析有了明显的提高，而且不同批次样品间基因表达的数据易于进行比较。这些独特的优势，使得RNA-Seq技术成为目前深入研究生物体转录组复杂性的强大工具。

利用RNA-seq技术系统分析高羊茅DREB2转录因子，为揭示高羊茅DREB2候选基因、剖析DREB2参与的植物抗逆调控分子网络提供了新的思路，将加快FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育种的步伐。