[发明专利]一种高特异性的叶酸完全抗原合成方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高特异性的叶酸完全抗原合成方法及其应用，属于生物化工技术领域。

背景技术

叶酸（folic acid或folate）又名碟酰谷氨酸，B族维生素之一，是氨基酸、嘧啶和嘌呤代谢中单碳转移的载体，对核蛋白的合成起辅酶作用；同时，叶酸也是许多细胞内酶反应的辅酶；叶酸的缺乏，会导致dTMP的合成受到限制，使DNA合成受阻，而产生巨幼细胞贫血。目前的研究已经证实，妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是神经管畸形发生的重要病因之一。叶酸与同型半胱氨酸代谢关系密切，对预防心脑血管疾病的发生具有重要的生物学意义。而且，也有研究表明，叶酸与许多癌症的发生、预防以及治疗相关。在我国，叶酸作为一种食品添加剂可以按照食品安全国家标准合法添加至食品中。

叶酸，化学名称N-{4-[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-喋啶）甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸，分子式C₁₉H₁₉N₇O₆，分子量441.40（按2007年国际相对原子质量），由蝶呤啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸结合合成。

目前，根据检测对象的不同，我国对叶酸的检测方法主要有比色法薄层层析法、气相色谱-质谱法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）、微生物法、同位素放射免疫法、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。

仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、亲和柱富集等前处理过程，存在制备复杂、繁琐的缺点，其检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。而无论是仪器分析方法前处理过程中的亲和柱富集还是免疫分析方法的检测过程中，其至关重要的影响因素还是高特异性的抗原和抗体。

传统的叶酸人工抗原一般采用混合酸酐法，小分子中的氨基可以在三级胺的作用下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与载体蛋白上的伯氨基反应，形成酰胺交联键。而叶酸小分子载体蛋白直接耦联，由于载体蛋白与小分子之间的空间位阻关系，最终通过免疫动物得到的抗体往往是针对小分子的部分结构的，抗体的特异性和灵敏度会受到很大影响，尤其是对喋呤、蝶酸、四氢叶酸、二氢叶酸和对氨基苯甲酸等物质的交叉现象不可避免。

动物免疫抗体的产生是与载体分子的结构有关的。同样，载体分子不仅影响产生抗体的数量，还影响着抗体的类型和亲和力。有研究表明，半抗原与载体结构之间的多原子间隔空间的存在更容易产生具有高特异性和高亲和力的抗体。

本发明是在载体蛋白上修饰具有一定空间长度的6-氨基己酸作为载体连接臂，将半抗原耦联到载体蛋白的连接臂上，形成载体与半抗原间具有一定空间间隔的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是针对现有叶酸抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的叶酸完全抗原合成方法，使得制备高特异性的叶酸单克隆抗体成为可能，本发明的另一目的是提供叶酸完全抗原的应用。

本发明的技术方案，一种高特异性的叶酸完全抗原合成方法，步骤为：在载体蛋白溶液中加入6-氨基己酸（ε-ACA）与水溶性碳二亚胺（EDC）后，室温下反应，透析后得到修饰了连接臂的载体蛋白B（式1所示）；叶酸（N-{4-[(2-氨基-1,4-二氢-4-氧代-6-喋啶)甲氨基]苯甲酰基}-L-谷氨酸）溶解于二甲亚砜（DMSO）中，加入二环己基碳二亚胺（DCC）与N-羟基丁二酰亚胺（NHS），反应生成叶酸衍生物，再加入载体蛋白B，调节反应pH值7.4，与载体蛋白B上的氨基进行偶联，透析，得到高特异性的叶酸完全抗原（式2）。将完全抗原透析，然后进行紫外鉴定（图1）。

载体蛋白修饰路线为：

式1 

叶酸人工抗原合成路线为：

式2

所述高特异性的叶酸完全抗原合成方法，具体步骤如下：

（1）修饰载体蛋白：取载体蛋白50mg溶解于5mL pH9.6碳酸盐缓冲溶液中，再加入100mg 6-氨基己酸，30mg水溶性碳二亚胺；调节体系pH值于6~8，室温下反应4h；用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次，即得到修饰了连接臂的载体蛋白B；

（2）叶酸完全抗原的制备：