[发明专利]一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，可对全血样本中白细胞及病原体的核酸进行快速提取。

背景技术

核酸检测技术的快速发展将分子诊断推向了前所未有的高水平。核酸检测的第一步就是对样本进行核酸提取。从全血样本中提取白细胞的核酸一直是比较复杂的过程，首先涉及到对全血中的红细胞进行裂解，离心除去不含DNA的红细胞，然后使用细胞裂解液对白细胞进行裂解，释放出核酸。该样本还需进行多个抽提和纯化步骤，才能得到直接用于分子检测的核酸。对全血样本中的病原体进行检测也是临床上常见的检测项目，获得全血中病原体的核酸同样要经历上述复杂的抽提过程。而且临床样本中的病原体含量往往较低，因此病原体的核酸提取效率高低是至关重要的，直接影响到实验的阳性检出率。

现在检测机构用得较多的对全血中白细胞和病原体的核酸进行提取的方法包括Trizol提取法（如Life Technology公司等），柱提法（如Qiagen、Roche公司等）和磁珠法（Chemagen、Thermo公司等）。Trizol提取法提取的核酸得率相对较低，且步骤较为繁杂，整个提取过程耗时1-2小时，直接影响检测效率。柱提法和磁珠法的试剂盒在一定程度上提高了核酸提取效率，对部分核酸提取步骤进行了简化，对提取速度进行了一定的提升，但整个提取过程仍需0.5-1小时。除了提取时间长，这些提取试剂盒的价格都极为昂贵，每一个样本的的提取约需人民币30-50元不等。因此针对全血样本的基因诊断急需操作简单、快速、价格低廉的样本前处理试剂，尤其当临床检测样本量较大时，简单快速的核酸提取显得尤为重要。

由于目前使用的全血样本核酸提取试剂盒及检测方法存在操作时间长、成本高、检测灵敏度低等问题，本发明提出了一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，仅需简单的三步就可以完成核酸提取，整个提取过程不超过10分钟，既简化核酸提取过程，同时也大大节约成本，且无需进行纯化便可直接用于扩增。由于本试剂盒具备核酸得率高、实验操作简单、实验条件简易、成本低等优点，可广泛用于对全血样本中白细胞以及病原体的核酸进行快速提取。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种全血样本快速裂解试剂盒，提取的核酸可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

1）从各种去污剂着手，筛选裂解细胞能力强的去污剂和最佳配比，以使整个裂解过程只需2分钟加热便能最大程度地释放病毒样本核酸。

2）在裂解细胞、释放核酸的同时，由于核酸的质量会影响PCR扩增的效果，需采用防止核酸降解，尤其需要研究防止RNA降解的技术。

通过反复的摸索，确定了全血样本快速裂解试剂盒各组成成分及浓度，该试剂盒核酸得率高、实验操作简单，无需复杂的实验设备且成本低廉。

本发明所提供的全血样本快速裂解试剂盒包括：（1）装有全血样本裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于全血样本裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、TE（pH7.4）组成。

本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为12g/L。

本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中二硫苏糖醇的浓度为40mmol/L～200mmol/L。

本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中TE（pH7.4）由20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA组成，pH为7.4。

本发明提供的全血样本快速裂解试剂盒可以提取全血样本中白细胞和病原体的核酸，其中病原体包括细菌、DNA病毒及RNA病毒，核酸包括DNA和RNA。

本发明另一个目的是提供一种全血样本快速裂解的检测方法，包括如下步骤：

（1）    取抗凝全血25 μl置于离心管中，加入25 μl 全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；

（2）    将混合物置于95 ℃孵育2 min；

（3）    将孵育后的混合物在12,000 rpm条件下离心3 min，收集上清，即为全血样本的核酸提取物。

该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。