[发明专利]一种在植物中快速表达外源蛋白的方法

说明书

本发明属于一种在植物中快速表达外源蛋白的方法。该方法包括以下步骤，①、植物材料的准备，②、病毒载体的构建，③、农杆菌重悬液的制备，④、利用高压喷枪系统侵染植物，⑤、侵染后植物材料的培养与观测，⑥、GFP的快速表达及检测。本发明为植物中简便、快速表达外源蛋白的一种新方法，利用该方法成功表达了绿色荧光蛋白GFP。在大量优化实验中，申请人对影响基因表达的各种因素进行了较为全面具体的研究，确定该方法最适侵染条件，包括菌液重悬液（MMA OD600）浓度，适合该方法的植物材料及侵染时期，植物材料培养的温度条件等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是一种在植物中快速表达外源蛋白的方法。

背景技术

近几十年中，大量研究表明植物生物反应器能够有效表达许多外源蛋白，包括人的血清蛋白，生长因子，抗体，疫苗等。目前，国外利用植物生产的药用蛋白已经用于临床实践阶段，植物生物反应器越来越显出其重要地位。植物生物反应器主要有两种表达体系，即稳定表达体系和瞬时表达体系。植物瞬时表达体系因具有快速，安全，有效等优点而越来越受到人们的青睐，也逐渐成为国内的研究热点之一，其实用价值和开发前景已获得普遍的肯定。

植物瞬时表达体系是以植物病毒载体为介导的，通过叶片注射法将携带病毒载体和外源基因的农杆菌重悬液注射到植物叶片，并实现植物中外源蛋白的表达。常用的侵染方法如叶片注射法和真空侵染法，叶片注射法需要逐片叶进行注射，其缺点是人工操作较为繁琐，费时费力，不适合大量植物的侵染，从而影响了其在外源蛋白生产上的进一步推广及应用。

利用植物作为生物反应器来表达外源蛋白是一种常用的方法。其中，植物瞬时表达体系具有潜在的应用价值和广泛的开发前景。其主要的侵染方法为叶片注射法和真空侵染法，但是，这两种方法都不适用于大量植物的侵染和外源蛋白的规模化生产。

发明内容

本发明的目的是要提供一种在植物中快速表达外源蛋白的方法，该方法是以植物病毒载体为介导，利用高压喷枪系统(型号HP-G6)将携带有病毒载体的农杆菌重悬液侵染植物烟草叶片，通过携带外源基因的病毒载体在植物体内的大量复制来表达外源蛋白，该方法简单的操作过程，较强的实用性，适合外源蛋白的快速表达和规模化生产。

本发明的目的是这样实现的，该方法包括以下步骤：

①、植物材料的准备：

植物材料为烟草，将烟草(Nb)的种子播种于1/2MS培养(现有技术)基中，放于光照培养箱，培养7-8天就可以长出烟草小苗，将烟草小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下培养18-20天，此时的烟草小苗的苗龄在四叶期—六叶期，作为植物材料备用；上述步骤中对植物材料侵染时期进行了优化，即分别选择苗龄为四叶期，五叶期和六叶期的烟草小苗，每个时期选择20株烟草小苗作为植物材料。

②、病毒载体的构建：

先将要表达的外源基因GFP连接在病毒载体p35S-30B上，再将质粒p35S-30B-GFP转化农杆菌EHA105，28℃条件下过夜培养，即可获得携带病毒载体和外源基因GFP的农杆菌EHA105-p35S-30B-GFP的单菌落。

③、农杆菌重悬液的制备：