[发明专利]一种在植物中快速表达外源蛋白的方法

权利要求书

1.一种在植物中快速表达外源蛋白的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

①、植物材料的准备：

植物材料为烟草，将烟草的种子播种于1/2MS培养基中，放于光照培养箱，培养7-8天长出烟草小苗，将烟草小苗移栽于花盆中，在25±3℃的温度条件下，每天光照16h和黑暗8h的循环条件下培养18-20天，烟草小苗的苗龄在四叶期、五叶期、六叶期，作为植物材料备用；上述步骤中对植物材料侵染时期进行了优化，即分别选择苗龄为四叶期，五叶期和六叶期的烟草小苗，每个时期选择20株烟草小苗作为植物材料；

②、病毒载体的构建：

先将要表达的外源基因GFP连接在病毒载体p35S-30B上，再将质粒p35S-30B-GFP转化农杆菌EHA105，28℃条件下过夜培养，获得携带病毒载体和外源基因GFP的农杆菌EHA105-p35S-30B-GFP的单菌落；

③、农杆菌重悬液的制备：

挑取上述步骤②中培养的单菌落EHA105-p35S-30B-GFP放入5ml LB培养基中，5ml LB培养基中添加浓度为50mg/ml的卡那霉素5ul、50mg/ml的利福平5ul，然后放入培养箱进行过夜培养16h，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28℃，培养后获得农杆菌菌液，然后将1ml的农杆菌菌液放入50ml LB培养基中，50ml LB培养基中加浓度为50mg/ml的卡那霉素50ul、50mg/ml的利福平50ul，再添加浓度为1mol/L PH5.6的苯磺酸Mes500ul、浓度为1mol/L的乙酰丁香酮AS10ul，再将上述农杆菌菌液放入培养箱中过夜培养，培养箱的转速设置为200r/min，培养温度为28℃，过夜培养16-18h，将过夜培养的菌液在3000r/min，4℃条件下离心20min来收集菌体，然后将菌体重悬于10mmol/LMgcl 2,10mmol/LMes,100umol/L AS，获得菌液重悬液；上述步骤中对农杆菌重悬液进行了优化，分别配制浓度OD 600为0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6的菌液重悬液，将菌液重悬液在侵染前放在暗室静置2-3h后备用；

④、利用高压喷枪系统侵染植物：

将步骤③中准备好的菌液重悬液和金刚砂按照3:1的比例混合，然后放入与高压喷枪相连的溶液管中，压力保持在0.1Mpa，高压喷枪的喷头距离叶面15-20cm，将菌液重悬液垂直喷射在步骤①中制备的烟草苗的叶片上，注意喷洒时喷枪不要距离植物材料太近，以免对植物叶片造成较大的伤害，所述金刚砂借助高压喷枪的压力在叶片上形成微小的伤口，使菌液重悬液携带的病毒载体和外源基因容易侵染植物的叶片，以保证较高的病毒侵染效率和外源基因的表达效率；

⑤、侵染后植物材料的培养与观测：

将上述步骤④中高压喷枪侵染的植物材料放入光照培养箱进行培养，黑室中，在紫外灯UV照射条件下进行观察，GFP表达的叶片表型为呈现绿色，未表达GFP的叶片呈现红色；上述步骤中对侵染后植物材料的培养温度进行了优化，在光照培养箱分别选择不同的培养温度22℃，25℃，28℃，31℃和34℃进行植物材料的侵染后培养，观察GFP的表达并计算GFP的表达效率表达GFP的烟草植株占总侵染株数的百分比；

⑥、GFP的快速表达及检测

用Trizol试剂提取表达GFP的植株的总RNA，在RNA水平上进行GFP表达的RT-PCR检测；利用PBS提取液提取植物总可溶性蛋白，进行GFP表达的Western Blotting检测。