[发明专利]检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，具体涉及一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

流感病毒是一种有囊膜的负链RNA病毒，属于正粘病毒科。流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白抗原性的不同，可以将其分为A、B、C三个分型，目前感染人的主要是A、B分型。A、B型流感病毒基因组分为8个节段，为单链、负链的RNA，分别编码至少10种以上的蛋白。A型流感病毒根据其表面细胞凝集素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)抗原性的不同，可以分为1-16种HA亚型和1-9种NA亚型。A型流感病毒可以感染多种动物，例如猪、鸟类、禽类和人，A型流感病毒极易发生变异，并且传染力极强，B型流感病毒一般只感染人类。

人偏肺病毒是一种比较常见的呼吸道感染病原体，在引起急性呼吸道疾病的所有病原体中，人偏肺病毒占3.9-18％，一般会引起下呼吸道感染，症状主要是咳嗽、流涕和发热等。

冠状病毒是一类有包膜的正链RNA病毒，在巢状病毒目里属于冠状病毒科，会引起呼吸道疾病。目前，已被发现的冠状病毒有五种，分别是OC43、229E、SARS、NL63和HKU1。冠状病毒约占所有呼吸道疾病病原体的1/3，是引起呼吸道疾病最常见的一类病原体。

A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、OC43型和HKU1型冠状病毒都是呼吸道病原体；而呼吸道感染症候群病原体的诊断可以分为传统方法和分子生物学方法。传统的检测方法一般有病毒分离、血清学诊断、液相芯片分析技术和酶联免疫反应等。随着分子生物学技术的快速发展，越来越 多的呼吸道病原体检测手段趋向于采用分子生物鉴别中，比如PCR、RT-PCR、Multiplex RT-PCR、MDD(molecular differential diagnoses，分子鉴别诊断)、Real-time RT-PCR、Duplex real time PCR等等。这些方法各有优缺点，比如PCR、RT-PCR只针对某个病原体单个型别和亚型的分子甄别，而Multiplex RT-PCR虽然能完成几个病毒型别和亚型的分子甄别。其中发展最快的是Real-time PCR。Real-time PCR是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Real-time PCR灵敏度高、特异性强、操作方便，目前已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。

但是在实临床中，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统单一的Real-time PCR方法，则要重复多次对每一种病原体进行PCR反应，工作量巨大，耗时较长，很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。因此多重荧光定量PCR是一种快速有效的检测多重呼吸道疾病的方法。2006年，旅美华人韩健博士发明了Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR技术)能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩增和检测，实现了一次PCR可以检测几种病原体。但Tem-PCR仍有一些不足之处，有待改进，例如灵敏度略低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管盖会造成实验室污染和假阳性，以及靶基因的检测和扩增尚未一体化等。因此，在A型流感病毒、B型流感病毒、人偏肺病毒NL63型、OC43型和HKU1型冠状病毒等呼吸道病原体的检测中并无能够一次直接快速精确检测的方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测时长只需2个小时左右、操作方便、成本低、杜绝交叉污染，并能突破常规PCR仪器荧光检测通道限制实现一次同时检测A和B型流感病毒、人偏肺病毒，以及NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；

所述病原体特异性引物包括：

A型流感病毒上游引物：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；

A型流感病毒下游引物：5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’；

B型流感病毒上游引物：5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3’；