[发明专利]检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；

所述病原体特异性引物包括：

A型流感病毒上游引物：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；

A型流感病毒下游引物：5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’；

B型流感病毒上游引物：5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG3’；

B型流感病毒下游引物：5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3’；

人偏肺病毒上游引物：5’-CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3’；

人偏肺病毒下游引物：5’-CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3’；

NL63型人冠状病毒上游引物：5’-GGCCATAAGATTGCTACTCGTG-3’；

NL63型人冠状病毒下游引物：5’-CTCCTGAGAGGCAACACCA-3’；

HKU1型人冠状病毒上游引物：5’-ATTCACTGTGTCTACTCAACCAC-3’；

HKU1型人冠状病毒下游引物：5’-CCGAAAGCAATGGGAACTCC-3’；

OC43型人冠状病毒上游引物：5’-GGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGG-3’；

OC43型人冠状病毒下游引物：5’-TGGCTCTACTACGCGATCCT-3’；

所述病原体基因探针包括：

A型流感病毒基因探针

5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’；

B型流感病毒基因探针

5’-CACCGCAGTTTCAGCTGCTCGAATTGG-3’；

人偏肺病毒基因探针

5’-TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-3’；

NL63型人冠状病毒基因探针

5’-GAATGCCCAACCAGTCTGGC-3’；

HKU1型人冠状病毒基因探针

5’-ATTATTCCTGGTTCTCCGGGATCACTC-3’；

OC43型人冠状病毒基因探针

5’-GCT CTG CTG GAT GTG CGC GAA GTA GA-3’。

2.如权利要求1所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照；

所述阳性对照包括连有A型流感病毒基因片段的载体、连有B型流感病毒基因片段的载体、连有偏肺病毒基因片段的载体、NL63型人冠状病毒基因片段的载体、连有HKU1型人冠状病毒基因片段的载体、连有OC43型人冠状病毒基因片段的载体。

3.如权利要求2所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述载体为大肠杆菌。

4.如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记物，该荧光标记物包括FAM、HEX、JOE、ROX和CYS中的一种或者多种。

5.如权利要求1至3任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应酶。

6.如权利要求1至5任一项所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取病患标样中的病原体核酸；

将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；

将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探针上标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同；

将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；

将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。

7.如权利要求6所述的检测A型和B型流感病毒、人偏肺病毒，NL63型、HKU1型和OC43型人冠状病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述混合反应系中A型流感病毒下游引物为0.4μM；B型流感病毒上游引物为0.4μM；B型流感病毒下游引物为0.4μM；人偏肺病毒上游引物为0.4μM；人偏肺病毒下游引物为0.4μM；NL63型人冠状病毒上游引物为0.4μM；NL63型人冠状病毒下游引物为0.4μM；HKU1型人冠状病毒上游引物为0.4μM；HKU1型人冠状病毒下游引物为0.4μM；OC43型人冠状病毒上游引物为0.4μM；OC43型人冠状病毒下游引物为0.4μM；A型流感病毒基因探针为0.2μM；A型流感病毒基因探针为0.2μM；人偏肺病毒基因探针为0.2μM；NL63型人冠状病毒基因探针为0.2μM；HKU1型人冠状病毒基因探针为0.2μM；OC43型人冠状病毒基因探针为0.2μM。