[发明专利]同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，具体涉及一种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法。

背景技术

流感的某些病状多是由于副流感病毒1-4型、冠状病毒229E和鼻病毒中的一种或者几种共同感染引起，比如在所有病原体感染的呼吸道疾病中1.9％感染了多种细菌类病原体，2.1％感染了多种病毒类病原体，15.2％共感染了细菌和病毒类病原体。而现有的对于引起上述病状病原的检测多采用两种：1)通过组织培养：对细胞中的病毒或直接检测存在于呼吸道分泌物中的病毒进行分离提取，使用免疫荧光实验、PCR、酶联免疫反应测定等方法进行逐一检测；2)针对病菌感染后检测在血清中产生的IgG特异性抗体或检测单一血清标本中特异性抗体IgM，通过特异性抗体的结果便逆推特异性的病原的类型。

上述检测方法，一次只能检测一种病原体，通过重复多次实现所有病原体的检测。临床上，引起感染症状的病原体可能多达几十种，如果采用传统的方法，则要进行几十个PCR反应，工作量巨大，耗时较长，很可能会耽误控制疾病蔓延的时机。所以，为了节约成本的需要，一种准确有效的能同时检查多种疾病的技术的出现，变得非常必要。2006年旅美华人韩健博士发明了Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR技术)能在一次反应中对多重靶序列进行高灵敏度和特异性的扩增和检测，为MDD(molecular differential diagnoses，分子鉴别诊断)带来革命性的变化。其利用多色荧光检测是通过对不同靶特异的检测探针标记不同波长的荧光基团，使不同的探针实现彼此的区分，从而根据实时PCR各探针荧光信号的升起的情况对不同靶的进行检测，从而通过这一技术实现多种病原体的同时检测。但是，在实施中PCR仪中可检测的单色荧光通道数目毕竟有限，最多可以有3-5个，因此在使用中无 法满足一次进行更多种病原体的同时检测。而且进一步地Tem-PCR仍有一些不足之处，比如在实施过程中，当几种荧光标记共同混合时产生敏感性低于real-time PCR，扩增时间较传统PCR长，检测时打开PCR反应管造成实验室污染和假阳性的可能，以及靶基因的扩增和检测尚未一体化等。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种在不增加单色荧光管通道下，能够快速、高灵敏度地同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，包括：

副流感病毒1型上游引物5’-GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3’；

副流感病毒1型下游引物5’-CCTACGGGACATCTCCAGAA-3’；

副流感病毒2型上游引物5’-ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3’；

副流感病毒2型下游引物5’-TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3’；

副流感病毒3型上游引物5’-TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3’；

副流感病毒3型下游引物5’-ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3’；

副流感病毒4型上游引物5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；

副流感病毒4型下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；

冠状病毒229E上游引物5’-ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3’；

冠状病毒229E下游引物5’-CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3’；

鼻病毒上游引物5’-TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3’；

鼻病毒下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；

病原体基因探针包括：

副流感病毒1型基因探针

5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；

副流感病毒2型基因探针

5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；

副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；