[发明专利]同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒及病原体检测方法

权利要求书

1.一种可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，包括病原体特异性引物和病原体基因探针；

其中，所述病原体特异性引物包括：

副流感病毒1型上游引物5’-GAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCA-3’；

副流感病毒1型下游引物5’-CCTACGGGACATCTCCAGAA-3’；

副流感病毒2型上游引物5’-ACCTAAGTGATGGAATCAATCGC-3’；

副流感病毒2型下游引物5’-TGCCCTGTTGTATTTGGAAGAGAT-3’；

副流感病毒3型上游引物5’-TGTTGAGCCTATTTGATACATTTAAGC-3’；

副流感病毒3型下游引物5’-ATGATAGCTCCACCAGCTGATTTT-3’；

副流感病毒4型上游引物5’-CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3’；

副流感病毒4型下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；

冠状病毒229E上游引物5’-ATGGCTACAGTCAAATGGGC-3’；

冠状病毒229E下游引物5’-CACTATCAACAAGCAAAGGGCTATAA-3’；

鼻病毒上游引物5’-TGGACAGGGTGTAAAGAGC-3’；

鼻病毒下游引物5’-GCATCTATACGAACACCTGCT-3’；

所述病原体基因探针包括：

副流感病毒1型基因探针

5’-AAT TGG CTC AGA TAT GCG A(G/A)A ACA C-3’；

副流感病毒2型基因探针

5’-TGT TCA GTC ACT GCT ATA CCA GGA G-3’；

副流感病毒3型基因探针5’-CGT AGG CAA GAA AAC ATA A-3’；

副流感病毒4型基因探针

5’-ACAATTACACTTGA“T”CCGTTAGCAAGACCCAT-3’；

冠状病毒229E基因探针

5’-CAC AAC GTG GTC GTC AGG GTA GAA TA-3’；

鼻病毒基因探针5’-TCC TCC GGC CCC TGA ATG-3’。

2.如权利要求1所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照；

所述阳性对照包括连有副流感病毒1型基因片段的载体、连有副流感病毒2型基因片段的载体、连有副流感病毒3型基因片段的载体、连有副流感病毒4型基因片段的载体、连有冠状病毒229型基因片段的载体、连有鼻病毒基因片段的载体。

3.如权利要求1或2所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光标记物，该荧光标记物包括FAM、HEX、JOE、ROX和CYS中的一种或者多种。

4.如权利要求2所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒，其特征在于，所述载体为大肠杆菌。

5.如权利要求1至4任一项所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取病患标样中的病原体核酸；

将试剂盒中病原体特异性引物用通用引物进行同源加尾；

将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述病原体基因探针标记的荧光标记物为一种或多种，且不同病原体基因探针上标记的荧光信号不相同；

将提取的病原体核酸、荧光标记后的病原体基因探针、同源加尾后的病原体特异性引物混合、并添加缓冲液制成混合反应系；

将混合反应系进行RT-PCR，并检测反应过程中荧光信号。

6.如权利要求5所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，所述将病原体基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记步骤中，所述副流感病毒4型基因探针用荧光标记物进行标记过程中，荧光淬灭集团标记于所述副流感病毒4型基因探针5’往3’端方向的第15个碱基上。

7.如权利要求5或6所述的可同时检测副流感病毒1至4型、冠状病毒229E和鼻病毒的试剂盒的病原体检测方法，其特征在于，所述混合反应系中副流感病毒1型上游引物为0.4μM；副流感病毒1型下游引物为0.4μM；副流感病毒2型上游引物为0.4μM；副流感病毒2型下游引物为0.4μM；副流感病毒3型上游引物为0.4μM；副流感病毒3型下游引物为0.4μM；副流感病毒4型上游引物为0.4μM；副流感病毒4型下游引物为0.4μM；冠状病毒229E上游引物为0.4μM；冠状病毒229E下游引物为0.4μM；鼻病毒上游引物为0.4μM；鼻病毒下游引物为0.4μM；副流感病毒1型基因探针为0.2μM；副流感病毒2型基因探针为0.2μM；副流感病毒3型基因探针为0.2μM；副流感病毒4型基因探针为0.2μM；冠状病毒229E基因探针为0.2μM；鼻病毒基因探针为0.2μM。