[发明专利]虫媒病毒液相芯片三重检测方法

权利要求书

1.虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亚- 刚果出血病毒CCHFV和裂谷热病毒RVFV三种，其中多重PCR扩增反应体系为： 

反应条件为：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4℃，hold；所述混合引物为上下游引物的混合物，上下游引物的浓度比为1:1-1:8；反应体系中所述模板可以为模板1、2、3种的任意一种或任意两种组合或三种；

2) 设计核酸探针并进行氨基化修饰，与荧光编码微球偶联制得微球混合液；

3) 设计偶联质控探针并加入到步骤2）得到的微球混合液进行偶联质量控制，所述偶联质控探针序列与步骤2）所述核酸探针序列互补；

4) 将PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。

2.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述基孔肯雅病毒CHIKV、裂谷热病毒RVFV和克里米亚-刚果出血热CCHF的引物序列为：

。

3.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述上下游引物的浓度比为1:8。

4.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述核酸探针和偶联质控探针的序列为：

。

5.根据权利要求4所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述序列中每个核酸探针的5^’端加10个poly(T)，再加氨基修饰，并对偶联质控探针的5^‘端进行了生物素标记。

6.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤2）所述偶联微球混合液通过如下步骤制得：

1) 随机选取带有不同编号的羧基化微球并活化；

2) 向活化微球中各加入100 pmol/μL的氨基化修饰的核酸探针3-5 μL，瞬时震荡；

3) 再各加3 μL核酸偶联活化剂，即10 mg/mL 的EDC到上述微球中，瞬时震荡；

4) 室温避光孵育30-45min；

5) 向上述微球中各加200 μL核酸偶联洗涤液A ，即0.02% 吐温-20，全速震荡5min；

6) 12，000×g 离心微球10min；

7) 弃上清，向上述微球中加入200μL核酸偶联洗涤液B，即0.1% SDS，全速震荡5min；

8) 12，000×g 离心微球10min；

9) 弃上清，不要触动沉淀；

10) 各加入100μL 核酸偶联微球贮存液，全速震荡或超声波悬浮微球5min制得偶联微球混合液。

7.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤3）偶联质量控制包括如下步骤：

1) 取偶联混合微球5μL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1， 即1.5×TMAC，稀释至33μL；

2) 将偶联质控探针稀释至0.01μM的混合液，取7μL偶联质控探针混合液，加入到含上述33μL微球混合液的1.5mL离心管中；

3) 然后用核酸检测缓冲液2 ，即1.0×TMAC，补足体积至50μL，52℃避光孵育15min；

4) 加入25μL 的10μg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50μL；

5）  液相芯片系统中进行测试，判断标准：空白质控荧光信号中值小于100，偶联质控荧光信号中值大于1000。