[发明专利]一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，涉及一种用于以β-环糊精、维生素C为底物合成AA-2G的环糊精糖基转移酶及其变体，具体为衍生自Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-11的CGT酶(cyclomaltodextringlucanotransferase)的环糊精糖基转移酶及其变体。

背景技术

维生素C是一种人体不能自身合成的水溶性维生素，在体内发挥重要的生理作用。然而，由于还原性强所导致的极不稳定性，使得其应用受到很大限制，因此，上世纪以来，开发既能保证维生素C的正常生理功能又具有较好稳定性的维生素C衍生物称为研究热点。

2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)为维生素C的糖类衍生物，因具有以下优点成为维生素C的最佳替代品：1)良好的非还原活性，在水溶液中稳定；2)良好的耐热性和耐光性；3)在胞内水解生产维生素C和葡萄糖，具有与维生素C同等的生物活性。

目前，在糖基转移酶催化下将供体上的葡萄糖苷转移到维生素C的2位C上是合成AA-2G的唯一途径。已经开发的用于合成AA-2G的酶有5种，其中环糊精糖基转移酶(CGT酶)因其底物特异性特别强称为合成AA-2G中使用最广泛的酶源。

环糊精糖基转移酶(CGT酶)是一个多功能型酶，能够催化包括环化反应、歧化反应、偶合反应以及水解反应在内的多种反应。通过偶合和歧化反应，CGT酶能够催化供体如淀粉或环糊精上的低聚糖转移至受体分子例如维生素C，显著提高受体分子的功能性、水溶性和稳定性。

现有技术中使用CGT酶生产AA-2G的主要问题在于：1)酶的热稳定性和贮存稳定性较差，不适合AA-2G的生产；2)转化率不高，较低的产量限制了AA-2G的大规模生产。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种环糊精糖基转移酶及其制备方法和应用，使环糊精糖基转移酶热稳定性和贮存稳定性更好，活性高，将该酶应用于生产AA-2G，提高产率，提高维生素C转化率，使该环糊精糖基转移酶适合AA-2G的大规模生产。

本发明的技术解决方案如下：

一种环糊精糖基转移酶，所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列在55位、77位、121位、331位、543位、604位或615位有1-5个的氨基酸残基置换的突变体。

所述突变为将55位的甘氨酸置换为丙氨酸、77位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、121位的甘氨酸置换为缬氨酸、331位的亮氨酸置换为异亮氨酸、543位的苏氨酸置换为酪氨酸、604位的天冬酰胺置换为甘氨酸以及615位的苯丙氨酸置换为丙氨酸。

SEQ ID NO:2所示氨基酸序列为Thermoanaerobacteriumxylanolyticum LX-11菌株的CGT酶的氨基酸序列。

根据本发明所述的环糊精糖基转移酶，优选的是，所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18所示的氨基酸序列。

根据本发明所述的环糊精糖基转移酶，进一步优选的是，所述环糊精糖基转移酶为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17所示。

本发明还提供一种编码所述环糊精糖基转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种制备所述环糊精糖基转移酶的方法，包括如下步骤：提取和扩增编码野生型CGT酶的DNA序列，利用易错PCR、定向进化技术建立突变文库，经筛选，获得所述新型环糊精糖基转移酶。

本发明还提供一种所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用。

根据本发明所述环糊精糖基转移酶在制备2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用，所述在制备2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用为将β-环糊精与抗坏血酸溶于水中，调节pH为5-7，加入所述新型环糊精糖基转移酶，在温度30-60℃反应，终止反应，经分离纯化得到2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸。

所述在制备2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用中将β-环糊精与抗坏血酸溶于水中，优选调节pH为5.5-6.0。

所述在制备2-氧-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸上的应用中，优选反应温度37-55℃。