[发明专利]一种非诊疗目的禽肿瘤性病毒多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种非诊疗目的多重PCR检测方法，可以同时检测禽网状内皮组织增生症病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒J亚群及A亚群。

背景技术

禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus，REV)、马立克氏病病毒(Marek’s disease viruses，MDV)禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)均可引起禽类的肿瘤性疾病和免疫抑制性疾病。这三种禽肿瘤性疾病都可以导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染，会减弱鸡群对各种疫苗的免疫应答能力，并加剧一些疾病的临床症状。严重危害着禽业的健康养殖。目前，对这三种肿瘤性疾病临床上并没有有效的药物用于治疗，对RE和AL也没有疫苗可以进行防御。世界各国主要通过抗原/抗体检测，淘汰阳性鸡，净化种群，对MD进行免疫等防治措施来控制这三种禽肿瘤性疾病。

临床上这三种疾病经常混合感染，增加了其临床快速诊断的难度，而目前常规的诊断方法，例如血清学诊断方法，病毒分离方法，病理组织切片观察法等都存在着敏感度低，耗时较长的不足，分离病毒方法耗时长且仅适用于实验室诊断；而免疫学检测方法例如ELISA、间接免疫荧光等都需要操作人员具备一定的专业知识，且还需要配备相关设备，并不适用于目前普通养殖场的实际条件；病理组织切片观察法精准但复杂耗时，不适宜临床的快速诊断；多重PCR方法具有敏感性高而且能够一次检测多种病原的优势，更加适用于现在混合感染的临床快速诊断。2002年，韦平等人研发的禽肿瘤性疾病快速鉴别诊断试剂盒就是依据多重PCR原理设计的三重PCR，可以检测REV、MDV、ALV三种病毒，快速简便，但是其未对ALV进行亚型分类且三种病毒的目的条带大小极为接近，不易区分。现有的多重PCR无法满足区分上述多种病毒的要求。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种针对禽肿瘤性病毒的非诊疗目的多重PCR检测方法，可以同时检测REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒，主要通过研究上述四种病毒的特性，分别采用4对特异性引物进行多重PCR反应，通过对反应体系和条件进行优化，筛选出最适反应条件，建立了能够同时检测四种病原的多重RT-PCR方法，用并于临床样品检测判定上述四种病毒是否存在，并且与病理组织切片观察法对照，准确率达95％，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。

发明人提供的具体技术方案如下：

利用现有已知REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒特性及其保守基因，发明人获得了4对特异性鉴定引物，其序列如下表所示：

利用上述4对引物对待测物进行多重PCR扩增反应，最终发明人优选的多重PCR扩增反应体系如下，每25μL体系为：

多重PCR反应条件为：放入PCR仪中心，以尽量避免边缘效应，编辑程序如下：第一步：95℃15min；第二步：95℃30s、53℃1min30s、72℃1min30s，连续40个循环；第三步72℃10min；最后保存于4℃；

PCR反应完成后，配置1.5％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，即可检测获得结果，其中可以直接通过观察是否出现阳性条带来判定阳性条带所指病原。

扩增所采用的模板为发明人通过如下方法获得：

将REV、ALV-J、ALV-A三种病毒接毒于DF-1正常细胞，7天后将上清液收集为扩增的病毒液，-80℃保存，将培养的DF-1细胞提取总RNA，逆转录后将cDNA-20℃保存；MDV强毒接毒于DEF正常细胞，7天后将培养的DEF细胞提取总RNA，逆转录后将cDNA-20℃保存。

上述采用的四种病毒毒株均为现有毒株，分别是REV(CHA株)，MDV(GA株)，ALV-J(NX-0101株)，ALV-A(SDAU09E2株)，均为市售可得毒株。

将四种cDNA用紫外分光光度计测定浓度，分别调整到同一浓度(150ng/μL)，等比例混合后(浓度为150ng/μL)作为PCR反应的模板。

凝胶电泳后选取与目的条带大小相同的亮带进行胶回收，然后链接转化测序，测序结果与Gen Bank上收录的参考毒株进行比对：REV-CHA(NC006934)、REV-USA(DQ387450)、MDV-GA(AF147806)、NX-0101(DQ115805)、SDAU09E2(HM452342)。比对结果证明亮带即为目的条带。