[发明专利]人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及人组织激肽释放酶检测领域，具体地指一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用，用于检测人组织激肽释放酶的活性。

背景技术

人组织激肽释放酶(TK)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。在人和动物的高血压、心血管疾病和肾脏疾病的模型中，均可见到TK含量的降低。我们在转基因的动物模型中发现TK具有降低血压，改善胰岛素抵抗，改善肾功能的作用。TK的水平在人的心血管疾病及肾脏疾病的发生发展的过程中可能具有重要的预测价值。

我们研究发现，TK的含量与脑卒中(缺血性脑卒中和出血性脑卒中)的发生呈剂量反应的负相关关系，并且这种现象能独立于传统的心脑血管疾病危险因素而存在。因此，TK可能是卒中患者的一个独立的保护因子。随后我们对所有卒中患者进行的5年随访中发现，血浆TK含量较高的患者具有较低的卒中复发率及较长的无事件生存时间。这说明TK不仅与脑卒中的发生有关还可能具有预防卒中复发的作用，并且降低的TK含量还可能作为脑卒中复发的预测因子。

研究发现TK启动子区的基因多态性与TK活性的降低及动脉的向心性重构密切相关。因此，TK基因的遗传变异可能会影响TK的表达、活性和功能改变。有文献报道尿中TK的活性与TK基因的遗传变异及高血压的发生密切相关。尿或血浆中的TK活性与脑卒中及其他心脑血管疾病的关系尚无相关研究报道。而由于血浆中的成分复杂，不利于直接检测TK的活性，所以有必要来建立一种能定量检测血浆中TK活性的试剂盒及其制备方法，从而解决血浆中蛋白成分复杂不利于TK活性检测的难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用，该试剂盒通过利用TK能与特异性抗体发生反应的特性与TK能催化底物苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)发生化学反应的特性相结合，从而解决血浆中蛋白成分复杂不利于TK活性检测的难题。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，该试剂盒包括：

1)包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；

2)人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品；

3)BAEE工作液，

其中，包被特异性抗人组织激肽释放酶的克隆抗体酶标板中的抗TK的抗体为抗11P的单克隆抗体或者抗11P的多克隆抗体。研究表明：抗原具有不同的抗原表位，不同的抗原表位结合不同的抗体，针对人组织激肽释放酶(TK)具有不同的抗原表位。当我们利用已有的四种抗TK的抗体作为捕获抗体制备反应板来检测标准品中TK的活性时，只有将抗11P的兔抗作为捕获抗体时制备的反应板所绘制的标准曲线对线关系良好。这说明只有用抗11P兔抗所制备的反应板能与TK结合的同时还能与BAEE发生反应。

进一步地，所述试剂盒还包括：PBST稀释洗涤液、稀盐酸、当量浓度为3.5N的氢氧化钠溶液、摩尔浓度为0.11M的氯化铁溶液和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液中任意一种或几种。

再进一步地，所述BAEE工作液的摩尔浓度为0.05M。

再进一步地，所述PBST稀释洗涤液中Tween-20质量分数为1％，所述稀盐酸的质量分数为13.73％，氢氧化钠溶液的当量浓度为3.5N、氯化铁溶液的摩尔浓度为0.11M和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液。

本发明还提供了一种包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板的制备方法，包括以下步骤：

1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：

2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；

3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；

4)称取磷酸二氢钾、12水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；

5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板。

本发明还提供了试剂盒在检测血浆及尿中TK活性的应用方法：包括以下步骤：

1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：