[发明专利]人组织激肽释放酶活性检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：

1)包被特异性抗人组织激肽释放酶克隆抗体酶标板；

2)人组织激肽释放酶融合蛋白TK-4T1标准品；

3)BAEE工作液；

其中，包被特异性抗人组织激肽释放酶克隆抗体酶标板中的抗TK的克隆抗体为抗11P的单克隆抗体或者至少含有抗11P的多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：PBST稀释洗涤液、稀盐酸、氢氧化钠溶液、氯化铁溶液和盐酸羟胺溶液中任意一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述BAEE工作液的摩尔浓度为0.05M。

4.根据权利要求2所述的人组织激肽释放酶活性检测试剂盒，其特征在于：所述PBST稀释洗涤液中Tween-20质量分数为1％，所述稀盐酸的质量分数为13.73％，氢氧化钠溶液的当量浓度为3.5N、氯化铁溶液的摩尔浓度为0.11M和摩尔浓度为0.2M的盐酸羟胺溶液。

5.一种包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：

2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；

3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；

4)称取磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；

5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板。

6.一种权利要求1～4任意一项所述的试剂盒在检测血浆及尿中TK活性的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)称取碳酸钠和碳酸氢钠，溶液水中得到pH为9.6且摩尔浓度为0.05的碳酸盐缓冲液；即包被缓冲液：

2)用上述包被缓冲液稀释抗TK的克隆抗体至3200倍，得到抗体溶液；

3)按每一孔加入100μl的比例吸取抗体溶液，并将抗体溶液加入96孔的酶标板内，在4℃条件下包被过夜，然后用BSA质量分数为1％的PBS液200μl于37℃封闭1h；

4)称取磷酸二氢钾、12水磷酸氢二钠、氯化钠。氯化钾和吐温-20制备得到Tween-20质量分数为0.1％的磷酸盐缓冲液PBST；

5)用步骤4)得到的PBST洗涤步骤3)中封闭的酶标板，用PBST洗涤2～3次，每次3分钟，拍干并密封，即得到包被特异性抗人组织激肽释放酶多克隆抗体酶标板；

6)将步骤5)得到的酶标板置于4℃条件下孵育24h，然后用质量分数为1％的BSA溶液封闭1h；

7)利用PBST稀释洗涤液稀释标准品和样品，将稀释后的标准品、样品和空白对照分别加入步骤6)中封闭好的酶标板中，并将酶标板置于37℃条件下反应60min；

8)向步骤7)的酶标板中加入BAEE工作液，在37℃条件下反应60min；

9)向步骤8)中的酶标板中加入氢氧化钠和盐酸羟胺的混合液，使之与未消耗的BAEE充分反应；

10)向步骤9)的酶标板中加入稀盐酸终止反应后加入氯化铁溶液显色；

11)通过酶标仪读数并绘制标准曲线，同时计算出TK的活性。