[发明专利]一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用BiFC指示细胞中Wnt信号活性状态的载体组合物及应用。

背景技术

经典的Wnt信号通路是一条保守而重要的信号转导通路，与胚胎发育、成体组织稳态、癌症发生都有着密切联系。在多种癌症中，例如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌等等，都已经检测到因为通路成员突变等多种原因造成的Wnt信号的异常激活。因此，对Wnt信号通路的研究以及以Wnt信号为靶点的药物筛选都具有非常重要的意义。

关于经典Wnt信号的工作模式，目前人们认为，当Wnt信号被激活时，降解复合体的功能被抑制，使得β-catenin得以在细胞质中积累，进而入核与转录因子TCF结合一同激活下游靶基因的转录。近年来，已经有许多基因被鉴定为Wnt信号通路靶基因，这些基因在细胞增殖、细胞存活、细胞代谢等多个领域都发挥着重要作用。因此，β-catenin与TCF家族成员(TCF1、LEF1、TCF3、TCF4)发生相互作用形成复合体被认为是Wnt信号过程中的关键步骤，成为Wnt信号转录调控的重要开关。该关键步骤也被认为是药物筛选的重要靶点之一。

为了显示Wnt信号在细胞内的活性状态，人们发明了多种方法。TOPFLASH报告系统便是一种广泛应用的方法，该系统可通过报告基因荧光素酶的表达显示Wnt靶基因的转录输出状态。

在双分子荧光互补技术(BiFC)系统中，荧光蛋白被截成N段、C段两部分，分别与两个目标蛋白构建为融合蛋白。单独的荧光蛋白片段本身不能发出荧光，并且在细胞空间范围内随机接近的几率很小。只有当两个目标蛋白之间发生相互作用时，才可以拉近荧光蛋白片段，有利于它们重组成完整的荧光蛋白进而发出荧光，如图1所示。BiFC可用于观测活细胞内蛋白分子间的相互作用，也可以通过其荧光定位显示互作发生的位置。BiFC在多种物种的细胞组织中均能使用，例如在哺乳动物细胞、植物组织、线虫等多种系统中都具有可行性。BiFC信号可在普通显微镜下进行检测，不需要特殊分析手段。BiFC系统可以在较低的蛋白水平下检测到荧光，并且只需要两个荧光蛋白片段之间具有一定的结构上的柔性。总体来说，BiFC为显示活细胞内蛋白之间的相互作用提供了直接、便捷、高精度的技术手段。

目前，还没有报道利用BiFC技术显示β-catenin水平及下游水平的蛋白互作情况。

发明内容

本发明的一个目的地是提供一种用于检测细胞内Wnt信号活性状态的融合蛋白组。

本发明提供的融合蛋白组，由融合蛋白A和融合蛋白B组成：

所述融合蛋白A包括β-catenin的C端缺失片段和位于其C段的荧光蛋白片段A；

所述融合蛋白B包括转录因子TCF和位于其N段的荧光蛋白片段B；

所述β-catenin的C端缺失片段为β-catenin蛋白氨基酸序列N末端起第2-667个氨基酸残基。

上述的融合蛋白组中，

所述融合蛋白A从N端起依次由所述β-catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；

所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF、连接肽和荧光蛋白片段B组成；

所述荧光蛋白片段A和所述荧光蛋白片段B来源于同一个荧光蛋白或不同荧光蛋白。

上述的融合蛋白组中，

所述TCF为TCF1、TCF2、TCF3、TCF4或其转录变体。

所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列2；

所述荧光蛋白为EYFP和/或Venus荧光蛋白；

所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第159-238位氨基酸；

所述荧光蛋白片段B为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第1-173位氨基酸或EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸。

上述的融合蛋白组中，

所述融合蛋白A从N端起依次由所述β-catenin的C端缺失片段、连接肽和荧光蛋白片段A组成；所述荧光蛋白片段A为Venus蛋白氨基酸残基自N末端第155-238位氨基酸；

所述融合蛋白B从N端起依次由所述转录因子TCF3、连接肽和荧光蛋白片段B组成；所述荧光蛋白片段B为EYFP蛋白氨基酸残基自N末端第1-158位氨基酸；