[发明专利]一种用于筛选肽类和非肽类GLP-1类似物的细胞株及其制备方法与应用

说明书

技术领域：

本发明属于药物高通量筛选检测技术领域，具体地，涉及一种表达荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS细胞株及其建立方法，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1类似物刺激后细胞内产生荧光斑点的形态变化来测定胰高血糖素样肽-1类似物生物活性及其受体激动剂、拮抗剂和调节剂的检测方法。

背景技术：

肠促胰岛素是在养分吸收以增加胰岛素分泌时胃肠道释放的激素。占肠促胰岛素大多数效应的两种肠道肽是：1)GLP-1(Glucagon-like peptide,胰高血糖素样肽1)：是由胰高血糖素原基因编码、在营养物质刺激下由小肠L细胞(Langerhans cell)分泌的含30或31个氨基酸的激素，GLP-1通过作用于胰腺β细胞而发挥促进胰岛素的分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，GLP-1及其受体广泛分布于中枢神经系统、胰腺和胃肠道系统。2)GIP(Gastric inhibition polypeptide or glucose-dependent insulinotropic peptide，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)：被十二指肠和近端空肠K细胞分泌。从小肠部位释放的几分钟内，GLP-1和GIP被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)进行迅速代谢(蛋白水解裂解)成无活性代谢物。小量活性激素到达胰腺作用于在beta-细胞上的受体位点以葡萄糖依赖方式刺激胰岛素分泌；而且GLP-1作用在alpha细胞和抑制胰高血糖素的分泌。目前基于肠促胰岛素的治疗主要分为两大类即DPP-IV抑制剂(如西格列汀、利拉利汀等)和GLP-1受体激动剂(基于Exendin-4治疗，如艾塞那肽；人GLP-1类似物，如利拉鲁肽)。

GLP-1目前被认为是最重要的肠促胰岛素，其发挥着大约70-80％的肠促胰岛素活性，所有这些生理特征均显示GLP-1将在2型糖尿病的治疗中发挥重要作用。新型降糖药物GLP-1受体激动剂可显著、持久降低糖化血红蛋白水平，并具有迅速、高效降低血糖，改善胰岛β细胞功能，降低体重等功效。无论是动物水平还是细胞水平，GLP-1受体激动剂均表现出抗高血糖的生理作用；促进胰岛素的释放，抑制胰高血糖素的分泌，延迟胃排空，促进β细胞的增殖和再生，抑制β细胞的凋亡。

GLP-1及其类似物的相关研究虽然已经取得了不错的进展，多种类似物也进入了临床试验阶段，然而由于多肽类药物具有一个共同的弊端，即不能口服给药，只能通过皮下注射，因此对于长期用药的二型糖尿病(T2DM)患者来说其依从性仍旧不高。由于多肽类药物的特性，其稳定性依赖于时间、温度及pH值，保藏条件要求较高。另外，由于这些激动剂都给人体引入了外源蛋白，可能会引发机体的免疫反应。目前上市的GLP-1类似物价格昂贵，会加重患者的经济负担。目前筛选小分子GLP-1类似物已成为研究热点。

建立有效的GLP-1类似物生物活性的测定方法，是评价新药药效的关键措施之一。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新的体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的肽类和非肽类激动剂、调节剂和拮抗剂的方法，提供一种表达荧光标记人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)蛋白细胞株GLP-1R/U2OS细胞株及其建立方法，XFP直接标记GLP-1R的C末端，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1类似物刺激后细胞内产生荧光斑点的形态变化来测定胰高血糖素样肽-1类似物生物活性的检测方法。

本发明以下述的技术方案来得以实现本发明的上述目的的：

一株GLP-1R/U2OS细胞株，由下述方法获得：构建人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)荧光蛋白(XFP)真核表达载体GLP-1R/pCMV6，并稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞，获得一株GLP-1R/U2OS细胞株。

所述的GLP-1R/U2OS细胞株含有的荧光蛋白(XFP)，是GFP(green fluorescence protein)、YFP(yelow fluorescence protein)、RFP(red fluorescence protein)或任何具有荧光性质的蛋白。