[发明专利]一种新型经血来源间充质干细胞分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及从经血中分离干细胞的方法，特别涉及一种新型经血来源间充质干细胞分离方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在发育生物学研究和临床治疗，如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景，MSCs最先在骨髓中确认存在，随后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪组织等处均发现有MSCs的存在。MSCs属于多能干细胞，在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型的细胞。目前成人骨髓是MSCs临床应用的最主要来源，但也存在一些缺陷，如成人骨髓中的MSCs的量非常少(约0.001％0.01％)。此外，在衰老和疾病状况下，骨髓MSCs的数量和分化潜能下降，且采集骨髓为创伤性过程。所以寻找其它的可替代MSCs来源十分重要。

经血是女性血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈粘液及阴道分泌物的混杂液体。近年来，美国的研究小组从健康女性的月经血中得到重复分离的干细胞；2008年，日本的研究小组也利用女性月经血成功分离培养出具有多重分化功能的干细胞，该干细胞可用于修复受损的心肌组织。

这种干细胞称为经血源性子宫内膜间充质干细胞(menstrual blood-derivedmesenchymal cells，MMCs)，有望用来治疗损伤和衰老的组织。MMSCs不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题。此外，MMSCs还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种新型经血来源间充质干细胞分离方法，采用如下技术方案：

一种新型经血来源间充质干细胞分离方法，包括以下内容：

a.收集经血：将经血转移到1～2倍经血体积的磷酸盐缓冲液中，得到混合物，并将混合物于4℃下保存；

b.将步骤a中得到的混合物在48h内，加入等体积的PBS缓冲液充分混匀，通过200目筛网过滤得滤液，将滤液用淋巴细胞分离管于2670rpm转速下离心17min，得到4层分离液，除去最上层分离液，提取中间白膜层物质，得到混合物A；

c.将步骤b中得到的混合物A加入PBS缓冲液中洗涤2～3次，然后离心，取沉淀细胞B；

d.将步骤c中得到的沉淀细胞B接种到培养基中，于37℃、体积分数5％CO₂的饱和湿度环境下进行培养；

e.收集步骤d中所述的培养的细胞，即为所述的经血来源间充质干细胞。

优选地，步骤a中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2，所述的磷酸盐缓冲液包括质量浓度为5ug/ml的EDTA、50ug/ml的枸橼酸钠、50～100mg/ml的海藻糖、0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑。

优选地，步骤c中所述的PBS缓冲液的配方为：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.2。

优选地，步骤d中所述的培养基包括质量浓度为1.34％DMEM粉末和0.22％NaHCO₃。

优选地，步骤d中所述的培养包括以下内容：每隔3～4天则去掉未贴壁的细胞，并更换培养基，培养的总时间为7～10天。

优选地，步骤d中所述的培养基，细胞首次传代前的培养基均含0.03～0.05mg/ml青霉素、0.05～0.1mg/ml链霉素、0.05～0.1mg/ml氟康唑，首次传代后的细胞所用培养基则不添加抗生素。

本发明的有益效果如下：

1.本发明提供的间充质干细胞分离方法，采用来源广泛的经血为材料，通过采用淋巴分离管法进行初步分离，利用干细胞贴壁生长的特性进行再次分离，并且将干细胞分离和扩增同时进行，可以得到纯度高、数量大的经血来源间充质干细胞。传统用于经血干细胞分离多采用淋巴分离液法，其离心时间长，对细胞的损伤较大，细胞得率低。