[发明专利]一种半合子CAPRI细胞制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种半合子CAPRI细胞的制备方法。

背景技术

CAPRI(Cascade Primed Immune cells)细胞又名级联引发的免疫细胞，是一项新型自体T细胞，利用抗原呈递细胞结合CD3单抗及特定细胞因子的链式激活工艺制备，兼具CIK的非特异性和DC的特异性杀伤能力，其效应细胞有两种：以CD4+和CD8+为主的T辅助细胞和T杀伤细胞（细胞毒细胞），约占80%，以CD3+和CD56+为主的NKT细胞、以及NK细胞和树突状细胞（DC），这部分效应细胞约占20%。近年来在肿瘤生物治疗方面非常活跃，具有安全有效、杀瘤谱广、副作用小等传统生物治疗的特点，还具有典型的个体化生物治疗模式的特点。

CAPRI细胞生物治疗的原理为：在肿瘤患者血液循环中含有一些肿瘤抗原，肿瘤有丰富的血供，单核细胞在血液循环中，能接触肿瘤细胞，而且肿瘤发生转移首先是到淋巴结，在这里有单核细胞，能接触到肿瘤抗原。单核细胞在体内大量接触过抗原并吞噬处理，并转化为DC，在第5天时能把处理后的肿瘤抗原递呈出来。CD3单克隆抗体体外活化的Ｔ细胞在特定细胞因子环境下会引起其他细胞，特别是抗原呈递细胞（APC）的激活。APC抗原呈递细胞可提呈外源蛋白，肿瘤蛋白作为变异的非自体抗原也可被其提呈。在APC中，树突状细胞（DC）是抗原提呈效力最高的一种细胞。如果未经活化的T细胞被加入到活化的呈递肿瘤抗原的APC中，Ｔ细胞便接受APC的抗原呈递并被活化，该过程的启动是通过特异性Ｔ细胞受体完成的，被活化的Ｔ细胞于是获得了特异性识别和杀伤肿瘤的能力。这种利用抗原呈递细胞结合抗CD3单克隆抗体及特定细胞因子的两步法链式反应激活的细胞被称为CAPRI细胞。CAPRI细胞结合了CIK的非特异性刺激和DC的特异性刺激。

由于CAPRI细胞在肿瘤治疗上的独特效果，从患者体内获取自身PBMC进行扩增和激活的方法已经十分成熟，较为经典的方法是德国申请WO02/087612A中公开的级联引发刺激过程：（1）起始的CD3激活阶段，将PBMC悬浮于培养基中，加入10%的HyClone胎牛血清，并且沉积到固定化的抗CD3单克隆抗体上；（2）IL2辅助阶段，在2-4小时CD3激活之后，加入IL-2，辅助激活并防止凋亡；（3）引发阶段，在2-3小时的IL-2辅助之后，将APC充分活化用于引发初始PBMC；（4）扩充阶段，将经引发的PBMC技术，重新悬浮在具有IL-2的补充培养基中；（5）72小时扩充后收获CAPRI细胞。然而，上述方法中获取PBMC时对患者身体状况具有严格的要求，在①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞的情况下，PBMC的采集无法实现，严重阻碍了CAPRI细胞治疗方案的实施。

针对上述问题，本发明提出了半合子CAPRI细胞制备方法。半合子是染色体有一半相同的个体，如子女和父母、父母和子女、兄弟姐妹之间，这三类关系的直系血亲都能做半合子法。在确定亲属半合子关系的前提下（如母女关系是确定的，母子关系也是确定的，但是父子、父女就不一定），是不用配型的。本发明所提出的半合子CAPRI细胞制备方法可有效避免由于①患者白细胞＜4000个/ml、②化疗后不到6周、③停止升白药物后不到2周、④患者体质差不能承受血细胞分离机采集单个核细胞过程、⑤其他不符合血细胞分离机采集单个核细胞所导致的PBMC无法采集的问题，使CAPRI细胞的治疗应用更加广泛；并且本发明培养方法中增加前期细胞处理步骤，以及双抗体装载方法有效提高了制备所获得CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。

发明内容

本发明提供一种半合子CAPRI细胞制备的方法，其适用于部分不适合利用血细胞分离机采集单个核细胞，无法满足CAPRI细胞培养所需单个核细胞数量的肿瘤患者。

此外，本发明还包括对CAPRI细胞制备步骤的改进，增加前期细胞处理步骤以及双抗体装载方法，以提高CAPRI细胞数目以及肿瘤杀伤能力。

本发明提供一种半合子CAPRI细胞制备方法，操作方法如下：(1)取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(2)从半合子供体血浆制备血清；(3)PBMC激活；(4) CAPRI细胞扩增；(5)CAPRI细胞收获；(6) CAPRI细胞冻存。