[发明专利]一种半合子CAPRI细胞制备方法

权利要求书

1.一种半合子CAPRI细胞制备方法，具体制备方法如下：(1)获取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化外周血单个核细胞(PBMC)；(2)从半合子供体血浆制备血清；(3)PBMC激活；(4) CAPRI细胞扩增；(5)CAPRI细胞收获；(6) CAPRI细胞冻存。

2.如权利要求1所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述获取患者和半合子供体外周血，并分离、纯化PBMC的步骤为：抽取患者、半合子供体外周血100-150 ml，加入终浓度为1.5×10⁵U/L的肝素钠抗凝处理，并根据所获取的外周血体积分装至50ml离心管中，1600-1800rpm离心20-30min，弃上清，并在离心管中分别加入25ml生理盐水，小心混匀，沿管壁缓慢分装到预先加有5ml Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000-2500rpm离心20min后，用巴氏吸管吸取从上向下第二层淋巴细胞层，然后继续用生理盐水1600-1800rpm离心5-10min洗涤两次，弃去上清，即获得PBMC。

3.如权利要求1-2任一项所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述半合子供体血浆制备血清的步骤为：将从半合子供体获取的血浆分装入50ml离心管中，2000-2500rpm离心20-30min，取上清，弃底部红细胞，56℃水浴30min灭活补体，2000-2500rpm/min离心20-30min，上清即为所需的血清。

4.如权利要求1-3任一项所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：PBMC激活步骤为：将浓度为1μg/ml 的CD3单克隆抗体包被于75cm²的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次，然后取5×10⁶个来自患者的PBMC，使其重悬于48ml含10%半合子供体血清的细胞培养液RPMI 1640(含L-谷氨酸)中，混匀分装到4个预先包被CD3单克隆抗体的75cm²培养瓶中，置于37℃、5%浓度CO2培养箱中培养，3小时后加入浓度为1000-1200U/ml重组人白细胞介素-2（rhIL2）、1000-1200U/ml重组人干扰素-γ（ rhIFN-γ）、200-300U/ml重组人白细胞介素-18（rhIL-18），继续培养3小时后，将半合子供体来源的10×10⁶个PBMC用无血清培养基72ml重悬，混匀后平均加到以上4个培养瓶中继续培养48小时。

5.如权利要求1-4任一项所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述CD3单克隆抗体为OKT3，该抗体可以特异性结合CD3分子非多态性ε链。

6.如权利要求1-5任一项所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：在进行PBMC激活操作之前，对来自患者的PBMC进行前期细胞处理，具体的所述前期细胞处理步骤为：用含有PHA-L、胞壁酰二肽(MDP)和IFN-γ的无血清培养基稀释至2×10⁶个/ml培养24小时，其中所使用的PHA-L的浓度为15μg/ml，MDP的浓度为5μg/ml，IFN-γ的浓度为1000U/ml。

7.如权利要求1-6任一项所述的半合子CAPRI细胞制备方法，其特征在于：所述PBMC激活步骤中使用的单克隆抗体还包括CD133单克隆抗体，即采用双抗体装载方式对PBMC进行激活，具体操作方法为：将浓度为0.5μg/ml 的CD3单克隆抗体和浓度为0.5μg/ml CD133单克隆抗体混匀后包被于75cm²的细胞培养瓶中，4℃过夜处理并在培养PBMC前用PBS缓冲液冲洗2次。