[发明专利]一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒的制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

隐蔽态真菌毒素是真菌毒素在一定的外界环境条件下，通过与糖苷、蛋白、脂肪、硫酸盐等物质相结合而形成，通常作用位点为真菌毒素的羟基部位。如T-2毒素的C3位和HT-2毒素的C3和C4位都能偶联糖苷或蛋白，形成隐蔽态。部分学者认为，食源性植物体内的隐蔽态真菌毒素，是在机体针对真菌毒素产生的一种解毒模式作用下形成的。极性较低的单端孢霉烯族毒素如玉米赤霉烯酮通过与部分糖类、氨基酸及硫酸盐等极性较高的物质相结合，性质发生改变，极性升高，并暂时性的降低了真菌毒素的毒性。然而，虽然真菌毒素在机体内转变为隐蔽态真菌毒素，可以暂时性的降低作用危害，但是隐蔽态真菌毒素的母核结构并未被破坏，仍然可能在机体内再次解离为前体毒素而造成危害。由于隐蔽态真菌毒素性质跟真菌毒素比较变化较大，如极性发生改变等，隐蔽态真菌毒素可逃避常规检测方法的检测，从而形成潜在的食品的安全问题。特别是在某些食品的加工过程中，真菌毒素容易在外部加工环境的作用下被转化为隐蔽态真菌毒素，从而逃离检测。这些便对隐蔽态真菌毒素的检测技术提出了更高的要求。

目前，对于检测真菌毒素的抗体检测方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道。中国专利，公开号CN1611944，公开了一种甘蔗花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液。盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，盒体内的用液还包括甘蔗花叶病毒云南分离物多克隆抗体、甘蔗花叶病毒云南分离物单克隆抗体。该方法仅用于检测甘蔗花叶病毒云南分离物，关于T-2毒素检测的试剂盒仍未见有报道。

现有的文献主要集中于游离态真菌毒素上的应用，未见有在隐蔽态真菌毒素上应用的报道。现有的检测真菌毒素的抗体方法包括普通ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。胶体金免疫层析法虽然有操作简单的优点，但是灵敏度比较低。而普通ELISA，其是以酶标板为载体制备试剂盒，由于酶标板固定的单面接触模式，限制了其检测的灵敏度，不能满足低剂量真菌毒素检测的要求。因此有必要建立一种灵敏可靠、简单快速、适于检测低剂量隐蔽态真菌毒素的方法，从而提高对真菌毒素的监控力度。而以免疫磁珠代替酶标板建立的ELISA便符合这一要求。免疫磁珠具有可分离和富集目标提取物的功能特性，磁珠上偶联的抗体或抗原可与待测物特异性结合，在经外界磁场的加持作用下，磁性小球可定向移动富集，从而达到分离富集的效果。免疫磁珠分离技术操作简便，耗时短，且分离富集效果好，将免疫磁珠技术与酶联免疫法相结合，建立的免疫磁珠酶联免疫检测技术与传统的酶联免疫检测相比较，灵敏度得到了很大的提升。与传统的ELISA相比较，磁性微粒作为载体对抗体的吸附能力是酶标板的1000倍以上。

发明内容

本发明的目的是提供一种可应用于检测隐蔽态T-2毒素的灵敏度高、操作简便、检测快速的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒，并公开了其应用方法。本发明区别于在磁珠上偶联抗体制备免疫磁珠的传统方式，采用包被法在羧基磁珠上包被T-2毒素母核抗原制备抗原-免疫磁珠，进而用其建立可检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠ELISA试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还具有免疫磁珠富集纯化目标物的优点，并且弥补了以酶标板作为载体导致灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。 

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含有洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液，还包括：

（1）包被抗原的免疫磁珠：以3-Ac-NEOS-HS-OVA为包被抗原，经PB缓冲液配制为200 μg/mL，在含有0.4 mg经EDC和NHS活化的羧基磁珠的离心管中加入1 mL包被抗原, 旋转重悬后，在37 ℃下，偶联3 h后，洗涤液洗涤2-4次，磁力架上进行磁分离去除洗液后，再向离心管中加入封闭液0.5 mL，37 ℃下，重悬旋转反应1-2 h，洗涤液洗涤2-4次制得；

（2）检测抗体：可识别隐蔽态T-2毒素的抗T-2毒素母核多克隆抗体；

（3）酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体；