[发明专利]一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒的制备及应用

权利要求书

1.一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含有洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液，还包括：

（1）包被抗原的免疫磁珠：以3-Ac-NEOS-HS-OVA为包被抗原，经PB缓冲液将包被抗原稀释到200 μg/mL，在含有0.4 mg经EDC和NHS活化的羧基磁珠的离心管中加入1 mL包被抗原，重悬后，在37 ℃下，偶联反应3 h后，洗涤液洗涤2-4次，磁力架上进行磁分离去除洗液后，再向离心管中加入封闭液0.5 mL，重悬37 ℃下反应1-2 h，洗涤液洗涤2-4次制得；

（2）检测抗体：可识别隐蔽态T-2毒素的抗T-2毒素母核多克隆抗体；

（3）酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体；

    （4）标准T-2毒素母核工作液：以T-2毒素作为标准母核供体，配制不同浓度的标准母核工作液。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含5%卵清蛋白或者5%脱脂奶粉的PB缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗T-2毒素母核多克隆抗体的制备方法为：免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA与弗氏完全佐剂进行1：1混合乳化完全，选择2.0-2.5 kg之间的大白兔进行免疫；后每间隔两周进行一次加强免疫，免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA与弗氏不完全佐剂进行1：1混合乳化完全，并于每次加强免疫后的第10天进行一次耳缘静脉采血，检测抗血清效价，当效价达到要求后，进行心脏采血，并进行抗血清纯化制备，得抗T-2毒素母核的多克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：所述PB缓冲液的制备方法为：先配制0.2 mol/L的Na₂HPO₄和0.2 mol/L NaH₂PO₄，取19 mL 0.2 mol/L的Na₂HPO₄和81 mL 0.2 mol/L NaH₂PO₄，充分混合即为0.2 mol/L PB缓冲液，pH为7.4-7.5。

5.一种用于检测隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠间接竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：以包被T-2毒素母核抗原的免疫磁珠为载体，隐蔽态T-2毒素与免疫磁珠竞争抗T-2毒素母核多克隆抗体，通过酶联免疫反应，间接检测样品中隐蔽态T-2毒素的含量；

具体方法为：

（1）利用纯化的T-2毒素母核免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA免疫新西兰种兔子，制备得高效价可识别隐蔽态T-2毒素的抗血清，硫酸铵沉淀法纯化抗血清得抗T-2毒素母核多克隆抗体；

（2）T-2毒素母核包被原免疫磁珠的制备：37 ℃环境下，活化后磁珠与T-2毒素母核包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA偶联旋转孵育3 h；用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次，每次间隔3分钟，用封阻缓冲液于37 ℃旋转孵育2小时，置于保存缓冲液中4 ℃保存待用；

（3）按照有机溶剂提取法处理样品，处理后样品与免疫磁珠混合重悬于含10%甲醇的PBS缓冲液中；加入T-2毒素母核抗体37 ℃下旋转孵育2.5 h，加入250 μL的稀释度为1：3000的酶标抗体，37 ℃旋转孵育2 h，磁分离，PBST洗涤三次；加入250 μL的TMB，室温反应15 min后，加入100 μL 2 mol/L的H₂SO₄，终止反应；磁分离，上清液至96孔酶标板中，450nm下检测OD值，根据标准曲线计算隐蔽态T-2毒素浓度。