[发明专利]一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法

权利要求书

1.一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，依次包括以下步骤：(1)对大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株进行培养；(2)对发酵培养所得菌体进行破菌收集包涵体；(3)对包涵体进行提取和洗涤，得到精制包涵体，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株为E.Coli K802(ply-4)，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：

a.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为28℃，150r/min，培养10-11小时；

b.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养8-9小时；

c.二级种子液培养：将一级种子液按增加1％的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气50L/min，罐压0.1-0.2bar，温度32℃，溶氧不低于50％，培养3-5小时，至OD600值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；

所述发酵罐培养包括如下子步骤：

a.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度120℃，25min，发酵罐自动在线灭菌；

b.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到25℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度从25℃逐渐升温至30℃，升温速率为5℃/h，在30℃下培养1.5小时后，于1小时内匀速逐渐升温至33℃，并在33℃下培养1小时后开始诱导表达；发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30％以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100-400L/min、罐压0.1-0.3bar；

c.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导3.5小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。

2.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述LB培养基的组份及其配比为：10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。

3.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述发酵培养基浓缩液的组份及其配比为：3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500g葡萄糖+1520g NaH2PO4+565g Na2HPO4。

4.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，上述发酵罐培养子步骤b和c中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加发酵补料培养基2L。

5.根据权利要求4所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述发酵补料培养基的组份及其配比为：100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。

6.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中包涵体提取和包涵体洗涤子步骤为：

a.包涵体提取：用10mmol/LPB-0.15mol/LNaCl-1mmol/LEDTA(pH＝7.5)溶液构成的重组人白介素-2发酵菌裂解液将菌体悬浮，利用APV高压均质机加压到500-600bar进行匀浆破碎，高压匀浆破菌两遍，释放包涵体，破菌率大于98％，然后用管式离心机连续流离心的方法收集ril-2包涵体；

b.包涵体洗涤：先用25mmol/L Tris-HCl+2M尿素溶液+0.5％曲拉通X-100重组人白介素-2包涵体洗涤液将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程离心收集沉淀，得精制ril-2包涵体。

7.根据权利要求1所述的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，其特征在于，还包括步骤(4)对精制包涵体进行变性处理：用20mmol/L Tris-HCl－10mmol/L DTT－8mol/L尿素将ril-2包涵体进行溶解，然后离心收集上清液。