[发明专利]一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法。

背景技术

白细胞介素2(InterLeukin-2，IL-2)是一种T细胞分泌的免疫调节因子，不仅能促进T细胞的增殖，还可增强NK等多种免疫活性细胞的活性，在免疫反应的产生、调节及免疫监视中起重要作用。近年来因其在肿瘤治疗中所起的重要作用而越来越受到人们的关注。自从1983年Taniguchi等首次克隆IL-2cDNA并成功地在猴细胞系COS-7中表达出IL-2以来，许多学者相继在E.coli中表达成功。由于重组白细胞介素2(rIL-2)具有天然IL-2的全部功能，用基因工程方法大量生产IL-2将满足实验室及临床应有的要求。

采用基因工程技术重组ril-2的生物学活性与天然的相似，可以大规模生产，以满足临床需要。但目前可参考的大多以超声破碎技术对所得大肠杆菌进行破碎，得到包涵体，这种做法不适宜大规模生产，而且很难进行工艺的放大，此外在工程菌发酵阶段也多采用50L以下发酵罐，扩大发酵规模会引入多种不稳定及难以控制的因素，导致生产效率不高。

本申请人曾发明过一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法(公开号为CN103233053A)，该方法中公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌。此生产方法生产周期短，生产效率高，生产规模大(500L)，特别适于工业化生产，降低了生产成本。特别是对于其中包涵体的提取方法，可收集到纯度较高的包涵体，从而减小了后续纯化的难度。

但是，当申请人采用上述方法，将工程菌种替换为E.Coli K802(ply-4)用以生产白细胞介素-2发酵包涵体时，发现ril-2的表达量很低，不足25％，从而导致所得包涵体的纯度很低，无法满足规模化生产要求。而后申请人根据E.Coli K802(ply-4)的菌种特性，通过正交试验的方法调整了工艺参数，但收效甚微，ril-2的表达量仍然较低，不足30％。产生上述现象的原因尚不明确，可能是由于当生产规模扩大到500L时，发酵过程中不稳定性因素增多，常规技术参数选择对E.Coli K802(ply-4)的适用性不佳。最后，申请人通过大量试验，对上述生产方法的工艺条件、培养基的组分等多方面进行了改进，通过严格控制每步中的生产流程，研发出了一种适用于E.Coli K802(ply-4)的重组人白细胞介素-2发酵包涵体的大规模(500L)提取方法，从而得到了本发明。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，该方法能够生产效率高，尤其是能够适应大规模的发酵包涵体提取。

本发明提供的一种重组人白细胞介素-2发酵包涵体的提取方法，依次包括以下步骤：(1)对大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株进行培养；(2)对发酵培养所得菌体进行破菌收集包涵体；(3)对包涵体进行提取和洗涤，得到精制包涵体，所述大肠杆菌表达重组人白介素-2的工程菌株为E.Coli K802(ply-4)，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：

a.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为28℃，150r/min，培养10-11小时；

b.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养8-9小时；

c.二级种子液培养：将一级种子液按增加1％的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100-300rpm/min，通气50L/min，罐压0.1-0.2bar，温度32℃，溶氧不低于50％，培养3-5小时，至OD600值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；

所述发酵罐培养包括如下子步骤：

a.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度120℃，25min，发酵罐自动在线灭菌；