[发明专利]一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供了一种人类嗅粘膜间充质干细胞的分离培养方法。包括以下步骤：1、配制由DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液；2、即时采集病员AS；3、将采集的AS加入配制出的人嗅粘膜间充质干细胞培养基中，在35℃～38℃、加3～7％的CO2。本发明可以高效快速的获得高纯度的嗅粘膜间充质干细胞，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潜能，本发明方法获得的嗅粘膜细胞具有较强的成脂能力、成骨能力、成神经干细胞能力和成神经元的能力，为在体外获取大量的具有干细胞运用于细胞和组织再生提供了新的方法。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有能自我更新、多向分化的能力。目前研究的MSCs主要来源于成人骨髓以及脐带血。对于成人骨髓来源的间充质干细胞，由于其数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且病毒感染率较高，加之供者的骨髓采集需进行骨髓穿刺术，故其获取受到一定的限制。

嗅黏膜间充质干细胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs)也称为外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，OE-MSC)。又因为定位于嗅黏膜固有层中，所以也称嗅黏膜固有层间充质干细胞(lamina propria mesenchymal stem cell，LP-MSCs)。1998年Huard JM等人首次发现在人嗅黏膜中存在干细胞且能够向神经元与非神经元细胞分化。大量研究证明：OM-MSCs具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性及类似的免疫表型，而且在体外能够向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、平滑肌细胞等分化，将嗅黏膜细胞植入鸡胚中，还能分化出典型的心脏，肌肉，肝脏，脑，脊髓等组织。OM-MSCs具有以下优点：①具有更强大的增殖效率和更短的传代时间；②位于鼻腔中，易于取材；③来源稳定，嗅黏膜终生可更新；④可自体移植，无免疫排斥反应；⑤安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外无限传代后没有基因变异；⑥无伦理道德问题。因此OM-MSCs在组织工程、细胞移植和基因治疗中将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法，本发明的有益效果是提取和培养的人类嗅黏膜间充质干细胞在传至10代后仍能维持干细胞的活性，保持干细胞的增殖和多项分化潜能。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：配制人嗅黏膜间充质干细胞基础培养基；

步骤2：采集病员本人AS(autologous serum)；

步骤3：将病员本人AS加入到人嗅黏膜间充质干细胞基础培养基中；

步骤4：鼻嗅黏膜获取；

步骤5：鼻黏膜放入培养皿中，用青霉素与生理盐水配比1∶1清洗3遍，清洗残余血迹；

步骤6：在培养皿中用无菌剪刀将步骤中洗浄的嗅黏膜剪成面积为1mm3组织块；

步骤7：将组织块置于离心管中与培养基充分混合振荡种植于细胞培养瓶中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养；

步骤8：细胞爬出之后换液，之后每隔3天更换一次培养基，继续培养。

进一步，所述步骤1中配制人嗅黏膜间充质干细胞基础培养基的步骤为：a：取DMEM和F12按1∶1混合而成的培养粉末，加纯净水至浓度为10～25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液，b：以1～10当量浓度的氢氧化钠调pH为7.0～7.5，c：层流细胞培养室抽滤消毒，4℃储存备用。