[发明专利]循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒以及方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)为进入人体外周血的肿瘤细胞，可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来研究表明，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强，脱离原发灶后进入血液形成循环肿瘤细胞。目前，根据CTCs抗原标志物的差异，可将CTCs分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)和间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)等。最新研究表明，间质标志物阳性表型的CTM具有最强的转移潜能。

目前，多数CTCs检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)，用相应的抗体捕获CTCs，以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。其中，代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统。由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，以及采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些CTCs由于发生EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到，从而导致假阳性和假阴性的检测结果，此外，免疫磁性分选(MACS)技术联合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法也是常用的CTC分离与鉴定的技术，但是RT-PCR过程对环境和操作的要求高，且mRNA容易降解，无法进行CTC细胞分型等缺点，因此，急需一种能够准确检测CTCs的技术，实现CTCs的的鉴定与精确分型的新技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能分型、灵敏度高的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。

在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰。

在其中一个实施例中，所述检测探针包括：

(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；

(2)针对每个标志基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。

在其中一个实施例中，所述检测探针包括：

(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的特异性序列P3互补配对的P2序列，所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；