[发明专利]一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR试剂盒及其检测方法。 

背景技术

耐万古霉素肠球菌(Vancomycin Resistant Enterococcus)是在1986年法国首次分离获得。从此之后，其他欧洲国家和美国相继检测并分离株耐万古霉素肠球菌菌株，目前已经成为重要的医院内感染病原菌。由于用药选择的严重受限，耐万古霉素肠球菌经常伴有较高的致病率和死亡率。因此耐万古霉素肠球菌目前已经成为临床院内感染的重要监控对象，一旦耐万古霉素肠球菌暴发传播，将会给抗感染治疗带来巨大的困难。 

在过去二十年中耐万古霉素肠球菌出现了发病率、严重程度和复发率上升的趋势，所有这些都与预后不佳有关，并已成为欧美排名第1的“超级臭虫”。现在美国已将耐万古霉素肠球菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、艰难梭菌并列于美国三大医院获得性感染之列。根据国外经验，为控制耐万古霉素肠球菌的广泛传播，最重要的是发展更为敏感和快速的检测方法，以及时发现，及早诊治。因此，实验室开发一种快速、特异、灵敏的耐万古霉素肠球菌基因检测方法意义重大。 

随着分子生物学技术的飞速发展。人们已经将实时荧光技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)PCR，广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量，是近几年发展起来的新型检测技术，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域。 

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种快速、准确、可定量的检验方法，能够及早发现耐万古霉素肠球菌，并且及时治疗。 

为实现上述目的，本发明提供一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括VanA特异性引物、VanB特异性引物、VanA荧光探针、VanB荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶、VanA基因、VanB基因、VanA基因标准品序列、VanB基因标准品序列。研究表明耐万古霉素肠球菌主要是由位于肠球菌基因组或质粒上的抗性基因引起，根据抗性基因差异分为VanA型、VanB型、VanC型、VanD型四种，其中只有VanA型、VanB型具有临床检测的意义，故耐万古霉素肠球菌基因选取VanA和VanB。 

所述VanA特异性引物如下：VanA上游引物：5′-ttgacttcgttcagtac-3′ 

                       VanA下游引物：5′-ggagcgaggacggatacagga-3′ 

所述VanA荧光探针如下：5′-FAM-ctagacctctacagccga-BHQ1-3′ 

所述VanB特异性引物如下：VanB上游引物：5′-ggatcaaatccggttgagc-3′ 

                       VanB下游引物：5′-tgtctgctggaacgataatca-3′ 

所述VanB荧光探针如下：5′-VIC-ccgcatccatcaggaa-BHQ1-3′。 

所述VanA基因标准品序列如下：ttgacttcgt tcagtacaat gcggccgtta tcttgtaaaa acatatccac acgggctaga cctctacagc cgagcgcttt atatattttt tttgccgttt cctgtatccg tcctcgctcc； 

所述VanB基因扩标准品序列如下：ggatcaa atccggttga gccacggtat cttccgcatc catcaggaaa acgagccggaaaaaggctca gagaatgcga tgattatcgt tccagcagaca。 

所述脱氧三磷酸核苷混合物为ATP、TTP、CTP、GTP等比例混合。