[发明专利]一种骨干质粒载体及应用

说明书

技术领域

本发明属于作物基因工程领域，具体涉及到一种用于作物基因打靶的骨干质粒载体及其在基因改造中的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，主要农产品的持续稳定增产对保障我国粮食安全具有十分重要的战略意义。种子是粮食生产的源头，优良的品种是确保农业高产、优质、稳产的重要基础。随着国民经济的不断发展，人口数目的持续增加和极端天气的频繁出现，加快品种改良对稳定农产品产量并满足时代发展对现代农业的需要至关重要。从上世纪中叶开始，以常规杂交选择为代表的传统育种技术培育了大量优良的品种，为农作物持续增产起到了重要作用。但随着重要基因资源不断的消耗，传统育种技术的瓶颈效应愈加显著。由于传统育种技术所具有的受生殖隔离限制、易受不良基因连锁影响、不同优势形状叠加的理论不清楚和周期长、成本高等不足，严重影响了突破性品种的选育速度。随着生物技术的不断发展，使用现代分子生物学手段直接精确改造形状相关基因，发展具有简单、快速、高效的新型改良手段，能够有效克服传统技术的不足，从而保障农作物品种持续和可持续的改良。

基因打靶技术是目前被认为最具有潜力的分子育种手段之一。基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)和类转录因子激活物技术(TALEN)，和最近发展出CRISPR/Cas9技术等。其中，前三者都具有打靶效率低，基因工程载体构建复杂，周期长，成本高等技术问题，影响了基因打靶技术在作物育种改良过程中的实用性。而CRSIPR/Cas9系统具有通量高、操作简单、打靶效率高等优点，是一种理想的基因打靶方法。目前，在酵母、人类细胞、小鼠、果蝇、大鼠、斑马鱼等物种中都已成功实现了基因组的CRISPR/Cas9定向基因打靶。在植物中，也有利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的研究。但是，在关于水稻方面的研究中，目前有限的报道主要侧重于机理研究，尚没有对作物CRISPR/Cas9载体工程化优化改造，使之适于简单快速操作的报道。

发明内容

本发明提供了一种用于作物基因打靶的基因工程骨干载体，其能够用于进行简单、快捷的基因打靶。

具体而言，一方面，本发明提供了一种骨干质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

另一方面，本发明提供一种骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1987至8635位所示。

优选地，所述向导RNA表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子，其中，所述小麦TaU3p启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至631位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1853至1936位所示，Poly-T终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1987至4018位所示，Cas9编码序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第4037至8308位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第8309至8635位所示。

优选地，所述骨干质粒载体还包括T-DNA的左、右边界序列，其中所述左边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第10884至10907位所示，所述右边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示；所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界和所述右边界之间。

优选地，在所述骨干质粒载体的骨架上具有卡那霉素抗性基因结构。

本发明的骨干质粒载体文中称为pHUN4c22。

另一方面，本发明提供一种利用所述的骨干质粒载体构建重组载体的方法，其特征在于，所述构建方法包括：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，以整合到所述骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA，