[发明专利]一种骨干质粒载体及应用

权利要求书

1.一种骨干质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.一种骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1987至8635位所示。

3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，

所述向导RNA表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子，其中，所述小麦TaU3p启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至631位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1853至1936位所示，Poly-T终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如SeqID No.1第1987至4018位所示，Cas9编码序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第4037至8308位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第8309至8635位所示。

4.根据权利要求3所述的骨干质粒载体，其特征在于，

所述骨干质粒载体还包括T-DNA的左、右边界序列，其中所述左边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第10884至10907位所示，所述右边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示；所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界和所述右边界之间。

5.利用权利要求1-4中任意一项所述的骨干质粒载体构建重组载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，以整合到所述骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA，

其中，所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也为碱基A、G、C、T中的任意一个。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-AGCG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-(N)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中所述正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N)_X具有反向互补特征；

用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，用所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过Kana霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于作物目的基因打靶的重组载体。

7.根据权利要求5或6所述的方法构建的重组载体在作物基因打靶中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

将所述重组载体转入作物细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，对目的基因的双链靶标片段进行剪切，诱发作物细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的作物植株，其包括利用所述作物细胞再生植株。

9.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求5中所述的重组载体。