[发明专利]检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒，特别是涉及一种以表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2在试剂盒中的应用，属于动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。

背景技术

副流感病毒（PIV）系单股负链RNA病毒目、副粘病毒科、副粘病毒亚科，是一类不分节段的单股负链RNA 病毒，可感染多种动物（包括人在内）。已报道的感染宿主有人、牛、犬、禽、猴、家兔、鼠、马、羊、雪貂、虎等某些野生动物。牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3, BPIV3)是引起牛和其它反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒。最近几年BPIV3 在我国内蒙、黑龙江、山东等地普遍流行。BPIV3 引起的病症为牛副流行性感冒，又称“运输热”，是一种急性接触性传染病，病毒对牛的致病力不强，但在其他继发性细菌（特别是多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（特别是长途运输中受寒、饥饿、拥挤、气候恶劣等）的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。同时，BPIV3 和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）一起构成了牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原。目前，牛呼吸道综合征是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界的养牛业。随着我国加入 WTO 以后，畜牧产品交易频繁，该病在我国养牛业发达地区广泛流行。临床预防和治疗中对该病还没有安全、高效的疫苗和药物，随着我国人民生活水平的提高，奶牛和肉牛养殖业的迅猛发展，养牛成为我国农民致富的手段之一，同时国内大型养牛企业也加大了牛养殖的投入，频繁的运输等因素使牛群发生BRDC的比率也随之上升。国外对牛群的BRDC监测和防制一直非常重视，实行严格的检疫、建立BPIV3感染阴性种群作为防制BRDC发生的有效措施，同时加强对健康牛群和可疑牛群的血清学监测，有针对性采取不同措施，减少BPIV3的感染和BRDC的发生，为牛群养殖创造良好的条件。因此，对养殖群体定期进行抗体阳性动物筛选，不断淘汰请群或者制定合适的综合防御措施，避免动物群的感染发病，广泛而深入地开展BPIV3感染的流行病学调查，进行BPIV3检测技术的研究，研制和开发BPIV3抗体和抗原监测试剂盒，为国内的BPIV3的防治提供技术支撑。

BPIV3的诊断目前主要依靠传统的分离病毒检测、免疫荧光检测和分子生物学检测方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）用于BPIV3的诊断仍处于研究阶段。由于ELISA更适合短时间内检测大批量的血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度，发展了ELISA、Dot-ELISA和阻断ELISA等几种方法。ELISA方法还有方便、易操作，利于在基层兽医部门和大型养殖区进行现地检测等优点。BPIV3 N蛋白为核衣壳蛋白(NP)，由约515个氨基酸组成，是病毒核衣壳的主要成份。NP编码基因为病毒的保守序列。 NP含有两个结构域，一个是N端结构域，与RNA结合，高度保守；另一个是C端结构域，裸露于装配完成后的核衣壳表面，含有对蛋白酶敏感的磷酸化位点和抗原结合位点，与负链RNA病毒基因组模板的活性有着密切关系。BPIV3 NP的C端与BPIV3抗体具有良好的反应原性，可以用于BPIV3感染和疫苗免疫后的诊断。因此，选择BPIV3 NP的C端保守序列，构建表达工程菌株，用表达的重组蛋白作为抗原，可建立检测牛副流感病毒3型抗体的间接ELISA诊断方法。

迄今为止，还没有检索到检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒的专利，特别是核心试剂制备方法和制备该核心试剂的生物材料。

 

发明内容

本发明目的之一在于提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，是以一种重组大肠杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行病毒感染和疫苗免疫后的诊断。

本发明另一个目的是重组大肠杆菌菌株在制备牛副流感病毒3型抗体试剂盒中的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，其特征在于：rN-C蛋白为NP基因C'端编码区的330bp 编码的第 391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为 330碱基的原核表达质粒；其具体的构建过程如下：