[发明专利]检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒

权利要求书

1.检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为 330碱基的原核表达质粒；其具体的构建过程如下：

(1)克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA 片段:以分离的牛副流感病毒3型基因组为模板RNA，通过RT-PCR 方法扩增得到N基因C'端330bp 片段含可表达的330bp ，将牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段与克隆载体pCR-blunt连接，经限制性内切酶酶切鉴定后，通过测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA 序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中登录号: JQ063064 对应序列完全相同；

(2) 构建原核表达载体pGEX-NP2:将上述测序准确的克隆质粒内的牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1的BamH I和Sal I多克隆位点之间；

(3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建:将步骤(2) 所述的原核表达载体pGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株；

(4) 牛副流感病毒3型NP的C'端330bp片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤(3) 所述的重组大肠杆菌BL21/ pGEX-NP2在含50mg/ml氨苄青霉素Amp 抗性的LB 液体培养基中培养，经异丙基硫代- ?-O 半乳糖昔IPTG 诱导，Western-blot 分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，重组蛋白大小为38KD，以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有良好的免疫学活性。

2.一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒，其特征在于：包括盒体、包被有已纯化的表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白作为抗原的酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗牛 IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色 A 液、底物显色 B 液、终止液和洗涤液；以表达的牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，用牛副流感病毒3型阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA 检测方法各最适反应条件的确定:封闭液的确定、样品稀释液的确定、血清最佳反应时间的确定、酶标抗体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。