[发明专利]美人鱼发光杆菌快速检测引物、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒及其检测方法，具体是一种采用环介导等温扩增技术对养殖鱼类致病菌进行快速检测的试剂盒及其检测方法，属于水产病原菌快速检测领域。

背景技术

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)为一种具溶血性的革兰氏阴性短杆菌，有荚膜，曾被称为杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)、美人鱼弧菌(Vibrio damsela)，寄生感染宿主不具特异性，对多种养殖鱼类均有高致病性，可引起美洲狼鲈、斑点叉尾鮰、日本五条鰤、军曹鱼、黄尾鰤、金头鲷等发病，在国内，已从发病的大黄鱼、半滑舌鳎、卵形鲳鲹、东星斑、龙胆石斑鱼等分离到该菌，是养殖鱼类的重要致病菌之一，具有很强的传染性，一旦发病，可造成很高的死亡率。由于水产动物特定的生活环境和生理特性，病害一旦发生，很难控制，往往造成巨大的经济损失，因此对于水产动物疾病，病原的早期检测与及时有效的预防治疗尤为重要。目前对于鱼类美人鱼发光杆菌的检测，主要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技术尚未建立，细菌分离鉴定耗时长，成本高，多以杀死水产动物为前提，操作复杂，需要专业的仪器设备和技术人员，养殖生产中急需一种能够应用于养殖现场的、快速准确、操作简便的美人鱼发光杆菌检测技术及其产品。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年建立的一种新型核酸等温扩增技术，其特征是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，在等温条件(60～65℃)放置30～60min即可完成核酸扩增反应，反应液中加入核酸染料SYBR Green I或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。LAMP的核心技术为特异性基因片段的选取及其引物的设计，引物不同，所建立的LAMP检测技术在反应准确性、特异性、灵敏性方面也有所不同。目前尚未有关于美人鱼发光杆菌LAMP检测技术的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种美人鱼发光杆菌快速检测引物。

本发明的第二个目的是提供一种能应用于现场检测的一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，对鱼体损伤小的、操作简便的不易出错的一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种美人鱼发光杆菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。

一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒，包括：

(1)样品预处理液，其组成为pH＝8.0的20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，体积浓度为1.2％Triton X-100，溶剂是蒸馏水；

(2)DEPC水；

(3)LAMP反应液，24μl LAMP反应液的组成为：2.5μl10×反应缓冲液；3μl浓度为2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物，1μl浓度为5μmol/L的由SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物；4μl1.6mol/L的甜菜碱；1μl钙黄绿素与锰离子形成的配合物、8.5μl DEPC水；

(4)阳性对照液，所述阳性对照液为1μg/ml的美人鱼发光杆菌基因组DNA；

(5)无菌封装的FTA膜片、研磨棒若干。

上述一种美人鱼发光杆菌快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)取待检样品组织加入100μl样品预处理液，研磨棒研磨，煮沸后静置10min，得到上清液；

(2)将FTA膜片在步骤(1)获得的上清液中充分润湿后室温干燥；另取两片FTA膜片分别在DEPC水、阳性对照液中充分润湿后室温干燥，作为阴性对照膜片和阳性对照膜片；