[发明专利]一种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与猪肌内脂肪相关miRNA标志物及其特异引物的应用，所述的miRNA标志物基因是基于猪的microRNA-133a3p基因，利用该基因作为内参基因通过实时荧光定量PCR方法检测microRNA在猪肌内脂肪中的表达量。

背景技术

随着人们生活质量的提高，消费者对猪肉的品质要求也相应的提高，比如猪肉的口感，多汁和嫩度。而肌内脂肪(Intramuscular fat，简称IMF)即大理石纹对猪肉的品质有着至关重要的作用(谭林和姜海龙，2010)。IMF主要分布在肌束和肌纤维之间，其从肌纤维间融化出来而使肉质鲜嫩多汁。研究表明，IMF与肉质优劣呈正相关，但IMF沉积的具体机制还不是很清楚。

IMF含量是由脂肪细胞的生长发育决定的，脂肪细胞的增殖和肥大可以促进IMF的沉积。有研究发现，涉及到脂滴代谢和脂肪形成的microRNA对脂肪细胞的形成有重要的作用(Xie et al.,2009)。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。有研究表明miRNA可以调节脂肪代谢和骨骼肌的分化(Krutzfeldt and Stoffel,2006)。为了揭示miRNA在猪的IMF形成过程中的作用，我们检测了236头纯种大白猪的背最长肌IMF含量，从中选取高低各3个个体，选取与肌内脂肪高度相关的几个miRNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行表达量的检测。

qRT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。然而在分析数据过程中，RNA样品之间，反转录效率，以及人为因素等都会对目的基因表达结果产生影响，因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，减少样本之间的差异(袁伟等，2012)。使用不理想的内参基因会对数据分析造成偏差。内参基因常常是看家基因，动物中常用的内参基因包括18S核糖体RNA(18S rRNA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)，U6，ATCB等，选择正确的内参基因很大程度上取决于所研究的组织、细胞及实验目的等。

目前还没有一种理想的内参基因可以完全用于任何实验条件，且表达恒定不变，申请人根据实验目的和样品类型的不同，应当选择合适而稳定的内参基因进行校正和标准化，以期得到可靠的实验结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与猪肌内脂肪相关microRNA标志物及其特异引物的应用，该microRNA标志物在肌肉中特异性表达，且表达量高，我们将其命名为ssc-miR-133a3p基因，本发明通过筛选得到一种与猪肌内脂肪性状相关的microRNA实时荧光定量(qPCR)内参基因，通过与动物常用内参基因U6和18S rRNA或其组合，提供双内参基因片段，通过双内标方法进行猪的肌内脂肪性状的检测。

在本发明中，申请人选择以U6为内参基因，研究microRNA的表达情况。结果发现U6在猪肌内脂肪中的表达稳定性较差，扩增效率不均一，同一批处理样品，U6的Ct值会有2-3个的差异，而ssc-miR-133a3p在相应组织样中的表达稳定性均优于传统内参基因U6，其主要特点是扩增效率高，适合用于本发明的需要。

更详细的技术方案如下所述：

申请人从NCBI数据库中克隆得到猪的U6，18S rRNA和ssc-miR-133a3p基因的核苷酸序列，NCBI数据库中miR-133a3p基因被著录的用途定义为与脂肪的沉积相关。

一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物在猪肌内脂肪相关检测中的应用，该标志物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。

一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，这些特异引物是如下所示的引物对和茎环引物，它们的核苷酸序列如下所示：

U6基因的引物：

正向引物：TCGCTTCGGCAGCACATATAC，

反向引物：CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC；

18S rRNA基因的引物：

正向引物：CGACCATAAACGATGCCGACT，

反向引物：GTGCCCTTCCGTCAATTCCT；

ssc-miR133a3p基因的引物：

茎环引物：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG，