[发明专利]一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物小分子有机物浓度测定的技术领域，具体涉及一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法。

背景技术

贵金属纳米粒子对其自身大小、形状及组成具有非常敏感的物理性质。尤其是金纳米粒子在可见光及远红外环境下，其纵横比的变化可以可以特别地表导致强烈的局部表面等离子共振（LSPRs）大的表面积和良好的生物兼容性等优点,广泛应用于化学和生物传感载体。

在生物技术领域，通常需要对样品中的葡萄糖浓度进行测定。由于葡萄牙被氧化后可产生过氧化氢，现有采用将葡萄糖分解出过氧化氢去蚀刻金纳米棒，由于在这一蚀刻反应中金纳米棒各个方向上的蚀刻效率不一致，最终可改变金纳米棒的纵横比后，使金纳米棒产生颜色变化，以比色法便确定样品葡萄糖的浓度。但现有的大部分纳米金属颗粒其对过氧化氢的敏感度降低，上述的蚀刻反应需在低pH、高温、高过氧化氢的环境下方可进行。而样品中的葡萄糖往往难以提供足量的过氧化氢，故上述的检测方法敏感度低。且在这种剧烈的反应条件下，样品常常会发生变质。因此现有的金纳米棒作为传感器测定葡萄糖浓度的方法实质上并无真正的实用价值。现有采用铁离子或铜离子等金属离子来做催化剂催化上述蚀刻反应的，但这种催化剂的特异性较低，对反应活化能的降低效果不明显，且其反应条件仍然较为剧烈，致使其无法被实际应用。

发明内容

有鉴于此，本发明公开一种对低浓度葡萄糖敏感的、特异性高、反应条件温和的利用比色法测定葡萄糖浓度的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其包括以下步骤：

采用葡萄糖氧化酶催化样品中的葡萄糖，使之释放出过氧化氢；同时向样品中添加辣根过氧化物酶与金纳米棒，辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻，待金纳米棒的颜色稳定后，采用比色法确定样品中葡萄糖浓度。

所述辣根氧化酶可采用市售产品实现，其由具有308个氨基酸残基的糖蛋白以及作为活性中心的血红素组成，并且能催化各种电子供体底物，包括2,3 - 二甲氧基苯酚，邻甲氧基苯酚，5 - 氨基-2,3 - 二氢-1，4的氧化 - 二氮杂萘二酮（鲁米诺），2,2' - 连氮基 - 双（3 - 乙基苯并噻唑-6 - 磺酸）（ABTS），3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）。该催化反应具有三个步骤。第一步，具有蛋白质外壳的复合氯化血红素被过氧化氢氧化，在氯化血红素和过氧化氢的一个氧原子间形成共价双键，获得具有氧化高价铁基(Fe^IV=O)的氯化血红素衍生物——化合物I。上述衍生物可通过单电子转移氧化第一底物分子，释放出π-正离子自由基。得到的的仍然具有氧化高价铁基的中间产物，即化合物II。第二底物分子通过单电子转移到含有Fe³⁺的三价血红素，从而使化合物II含量下降。在这一过程中，氧获得两个质子形成水分子，从而从所述氧化高价铁基中释放出来。如下面的方程所示，在上述的HRP反应循环中，两个底物分子(AH)被转化为两个自由基（A.）。

Native HRP+H2O2→Compound I^.+

Compound I^.+ +AH→Compound II⁺+ A^.

Compound II++AH→ Native HRP+H2O+ A^.

本发明中，采用了辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻反应，辣根过氧化物酶能够有效降低上述蚀刻反应的活化能，使反应能够在温和的条件下进行。同时，由于反应的活化能降低，微量的过氧化氢也能够与金纳米棒发生反应，从而有效提高了本发明检测方法的灵敏度。同时，作为活性中心的血红素只能与特异性的底物——即过氧化氢和金纳米棒——结合，因此本发明的方法也具有良好的特异性。所述的比色法可以采用现有的比色法实现，具体而言，即首先配置一个浓度梯度的葡萄糖标准溶液，按照上述的检测方法，使之与金纳米棒反应，当金纳米棒不再变色后，根据金纳米棒最终的色度制作不同浓度的比色卡。

进一步的，还包括在辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒蚀刻前，添加卤化物。