[发明专利]一种埃博霉素的膜提取分离工艺

说明书

技术领域

本发明属于一种抗肿瘤化合物的过滤提取方法，具体涉及一种埃博霉素的膜提取分离工艺。 

背景技术

埃博霉素 (epothilone)是一类大环内酯类化合物，具有很强的抗肿瘤活性，能在较低的浓度杀死癌细胞，生物合成主要是通过粘细菌发酵来生产埃博霉素，生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，在相关人体细胞系中研究后发现，埃博霉素a抗癌效果弱于紫杉醇，而埃博霉素b抗癌效果强于紫杉醇，目前主要以埃博霉素b的效价来衡量产量。 

生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，其过滤一般是通过树脂解析的方法，但昂贵的设备，提取量小，并且埃博霉素a,b不能高效的分离，已成为目前制约埃博霉素a,b工业化生产的一个因素之一。 

膜是具有选择性分离功能的材料。利用膜的选择性分离可以实现不同组分的分离、纯化、浓缩的过程。埃博霉素a,b在提取的过程中往往要用一些化学溶剂如甲醇/丙酮等进行解析，膜分离是典型的物理分离过程，不用化学试剂和添加剂，对环境保护有着积极的意义。 

发明内容

    本发明的目的是针对目前埃博霉素提取分离方法的缺陷，提供一种埃博霉素的膜提取分离工艺，该方法达到了埃博霉素a,b的高效分离。 

为了达到成目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种埃博霉素的膜提取分离工艺，包括以下步骤：

 1）将埃博霉素发酵液经过有机膜过滤，得到有机膜过滤液，再以过滤液20%体积量的蒸馏水进行清洗，合并有机膜过滤液和洗液，再经陶瓷膜过滤后得到陶瓷膜过滤液；再以过滤液10%体积量的蒸馏水进行清洗膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa；

 2）将步骤1）得到的陶瓷膜过滤液和洗液上凝胶色谱柱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b的总色谱纯度达到80%以上的流分,收集到的洗脱液再经纳滤膜浓缩，得到纳滤浓缩液后，将浓缩液经过正相硅胶色谱洗脱，HPLC检测洗脱液，收集埃博霉素a和b色谱纯度各达到95%以上的流分，将分别收集到的洗脱液低温结晶后分别得到埃博霉素a和b结晶；膜工作温度为25~40℃，压力为0.05Mpa~0.3Mpa。

步骤1）中所述有机膜规格为5000~6000截留分子量。 

步骤1）中所述陶瓷膜规格为1000~1500截留分子量。 

步骤1）中所述蒸馏水清洗流程为每次添加5%体积量的洗液进行容器和膜的润洗。 

步骤2）中所述凝胶色谱柱为SephadexG-15。 

步骤2）中所述凝胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1:1~7配置而成。 

步骤2）中所述纳滤膜为500~800截留分子量。 

步骤2）中所述正相凝胶色谱的硅胶用量与浓缩液量的质量比为5-10 ：1。 

步骤2）中所述正相硅胶色谱洗脱的洗脱液为：丙酮与石油醚按体积比为1：1~6配置而成。 

步骤2）中所述低温结晶温度为-30℃~-10℃。 

    有益效果：本发明采用有机膜、陶瓷膜进行过滤分离，埃博霉素a,b发酵液中的杂质大分子95%以上都得以去除，提高了滤液品质；本发明采用凝胶色谱、纳滤膜进行浓缩，基于膜的高效性，大幅度提升了产品质量，降低了产品成本和操作难度；本发明采用正相凝胶色谱洗脱，低温结晶分别提取出浓缩液中的埃博霉素a,b，达到了埃博霉素a,b的高效分离，减少了有机溶剂的使用量，优化了提取工艺，降低了成本。 

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步描述， 

将本实验室筛选出的埃博霉素高产菌YU-970（保藏编号：CCTCC NO：M 2014144）的10L发酵罐中加入沉降体积为10%的XAD-16大孔吸附树脂，发酵结束后，取树脂于38℃烘箱内烘干，并加入5ml蒸馏水浸泡每株突变菌株发酵的树脂，浸泡树脂24h解析并收集两次解析液，得到本实验所用埃博霉素发酵液，经HPLC检测产量埃博霉素a含量为320mg/L,埃博霉素b含量为230mg/L，总含量为550mg/L。

埃博霉素发酵液并不限定于上述发酵液，可以使用任何菌株发酵所得的含埃博霉素a,b成分的发酵液。 

实施例1