[发明专利]一种发酵培养基及利用其生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法

说明书

本申请为申请日2013年4月16日，申请号为201310131566.3，发明名称为“黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及发酵培养基”专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域中质粒DNA疫苗的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基，特别是涉及一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。

背景技术

质粒DNA疫苗是近年来经研究发现的一种极具发展潜力的新疫苗，从上世纪九十年代初期质粒DNA疫苗受到了科学家的关注，到现在发展近三十年，已经有了长足的发展。质粒DNA疫苗具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点，因此，同活病毒和病毒基础的疫苗相比，其具有独特的优势。数百项疫苗进入临床试验阶段，目前已有4种动物用质粒DNA疫苗及产品上市(Michele AK,David BW.DNA vaccines:ready for prime time？Nature Reviews Genetics,2008,9:776-788.)，人用质粒DNA疫苗及产品呼之欲出。因此，随着质粒DNA疫苗及产品的快速发展，建立符合药用标准的质粒DNA的大规模生产平台成为一个重大的研究课题。本发明针对质粒DNA疫苗的发酵工艺进行探索，是质粒DNA疫苗大规模生产发展中的基石，其重要性不言而喻。

在质粒DNA疫苗大规模生产中，建立稳定的质粒DNA(或简称质粒)的种子库非常关键，由于质粒DNA(pSVK-CAVA)的分子量比较大，达到15kb左右，对于宿主菌是一种沉重的负担，在宿主菌的生长过程中，极易造成质粒DNA的不稳定性。质粒DNA的不稳定性，是指工程菌在生长过程中质粒DNA发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒DNA的不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性(Filomena AQ,Fernanda CD.Plasmid DNA fermentation stratagies:influence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology,2012,93:2571-2580.)。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒DNA的丢失；结构不稳定则是由于质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒DNA的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒DNA产量和质量。如果发生质粒DNA的分离不稳定，由于部分质粒DNA的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒DNA的宿主菌的混合培养(Clarence MO,Raelene P,Diane W,et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-based Measles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation and pH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011,10:16.doi:10.1186/1475-2859-10-16.)，在非选择性条件下，含有质粒DNA的工程菌的比生长速率(μ⁺)往往小于宿主细胞的比生长速率(μ^-)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒DNA的细胞。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌来提高质粒DNA的生产率是非常重要的。